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乙型肝炎病毒(HBV)是一种DNA病毒,它可以导致慢性乙型肝炎,严重危害人类健康。干扰素(IFN)类和核苷酸类被广泛运用于临床。然而,慢性乙型肝炎的治疗是一个长期过程,在用IFN-α治疗时,随着时间的延长和用药次数的增加,HBV对IFN-α的敏感性会下降,使得IFN-α抗HBV作用减弱。大量临床研究也发现,乙型肝炎患者在长期运用IFN-α治疗时,很容易导致耐药性的出现,这为乙型肝炎的治疗带来了巨大的挑战。IFN-α主要通过JAK-STAT信号通路发挥抗病毒作用,而信号传导及转录激活因子1(STAT1)在这个通路中发挥重要作用。研究表明,STAT1的表达及其修饰影响IFN-α抗HBV活性。因此,研究STAT1的变化及其相关蛋白和基因的表达情况,对于研究IFN-α治疗HBV有着重要意义。Hep G2.2.15细胞是抗HBV新药开发的一个良好的体外研究工具,它能够在体外进行无性繁殖,并能长期稳定分泌HBs Ag,、HBe Ag和Dane颗粒,是体外筛选抗HBV药物的良好模型。本课题组通过小剂量IFNα-2b(50 IU/ml)长期(6个月)不断刺激Hep G2.2.15细胞,建立耐IFNα-2b的Hep G2.2.15细胞模型。耐药细胞株对IFNα-2b敏感性降低,对HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的抑制作用明显减弱。本课题组设计实验探究Hep G2.2.15细胞、Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞JAK-STAT信号通路中STAT1与耐药的关系及可能的作用机制。目的通过小剂量IFNα-2b(50 IU/ml)长期(6个月)不断刺激HepG2.2.15细胞,建立耐IFNα-2b的Hep G2.2.15细胞模型——Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞,探究Hep G2.2.15细胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞JAK-STAT信号通路中STAT1与耐药的关系及可能的作用机制。方法1.实验采用Western blot法分别检测不同浓度(0,250,500,1 000 IU/ml)IFNα-2b作用72 h,对照组细胞、3个月刺激组细胞以及6个月刺激组细胞p-STAT1、STAT1蛋白表达情况,并探讨p-STAT1/STAT1的差异。2.以Hep G2.2.15细胞为对照组细胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞为模型组细胞,对照组细胞和模型组细胞相同数目下培养24 h,收集细胞上清液,采用ELISA法检测其HBs Ag、HBe Ag的量,PCR-荧光探针法检测HBV DNA量。探讨Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA的表达量变化。3.以Hep G2.2.15细胞为对照组细胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞为模型组细胞,对照组细胞和模型组细胞相同数目下分别给予0,IFNα-2b(1 000 IU/ml)作用24 h,分别和不给药组比较,采用ELISA法检测其HBs Ag、HBe Ag的量;采用PCR-荧光探针法检测HBV DNA的量;采用Western-blot检测STAT1、p-STAT1、OAS1蛋白表达情况,采用q RT-PCR检测法检测STAT1、OAS1、USP18的m RNA表达情况。探讨IFNα-2b对Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞抗HBV活性变化。4.以Hep G2.2.15细胞为对照组细胞,Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞为模型组细胞,对照组细胞和模型组细胞相同数目下分别给予0,IFNα-2b(1 000 IU/ml),IFNα-2b(1 000 IU/ml)+JAK抑制剂(1μM),IFNα-2b(1 000 IU/ml)+TSA(30 nmol/ml),IFNα-2b(1 000 IU/ml)+JAK抑制剂(1μM)+TSA(30 nmol/ml)24 h,采用ELISA法检测其HBs Ag、HBe Ag的量;采用PCR-荧光探针法检测HBV DNA的量,采用Western-blot检测p-STAT1、STAT1、OAS1蛋白表达情况,采用q RT-PCR检测法检测STAT1、OAS1、USP18的m RNA表达。通过JAK抑制剂、HDACi影响JAK-STAT通路中STAT1的磷酸化和乙酰化水平,观察IFNα-2b抗HBV活性变化。探讨JAK抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)对Hep G2.2.15/IFNα-2b细胞IFNα-2b抗HBV活性的影响。结果1.小剂量IFNα-2b(50 IU/ml)刺激6个月的细胞在给予不同浓度的IFNα-2b后,和对照组细胞比较,STAT1蛋白表达上调,p-STAT1蛋白表达下调,且p-STAT1/STAT1下降明显。2.模型组细胞分泌HBs Ag、HBe Ag量较对照组轻微增加,HBV DNA量降低,但均不具有统计学意义。3.在给予IFNα-2b作用后,IFNα-2b对模型组细胞的HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA抑制作用降低。与对照组相比,模型组细胞STAT1蛋白表达增多,但磷酸化的STAT1表达下调,同时,磷酸化的STAT1占STAT1比例降低。STAT1、USP18的m RNA水平上调,OAS1 m RNA水平下调。4.JAK抑制剂、HDACi对对照组细胞和模型组细胞IFNα-2b抗HBV活性有着不同程度上的影响。JAK抑制剂、HDACi对对照组的影响程度大于模型组细胞。结论1.长期小剂量IFNα-2b刺激Hep G2.2.15细胞后,细胞对IFNα-2b敏感性降低,表现为IFNα-2b对HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA抑制作用的减弱。2.JAK-STAT信号通路中STAT1的磷酸化水平下调,是导致HBV对IFN-α产生耐药的部分原因。