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1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸(1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidine carboxylic acid)又称四氢嘧啶(ectoine),是一种渗透压补偿溶质。分子量142.2g/mol,分子式为C6H10N2O2,为环状氨基酸的衍生物。四氢嘧啶能够平衡渗透压的特质与其可以稳定和保护大分子如蛋白质、DNA以及酶等的功能,使其具有较高的开发利用价值。本文以吉兰泰盐湖的土壤为材料,共分离获得29株嗜盐碱放线菌。对分离获得的菌株进行16S rDNA酶切多态性分析,并对代表菌株进行16S rDNA序列测定,其中获得3株拟诺卡氏菌株。80%乙醇法抽提分离获得菌株胞内的四氢嘧啶,然后进行薄层层析定性检测相结合,快速筛选出能够生产相容性溶质四氢嘧啶的放线菌。Streptomyces pactum Act12是1株多功能放线菌株,TLC定性检测可知其能够产生相关耐盐的相容性溶质四氢嘧啶。Streptomyces pactum Act12可在NaCl范围为0~10.0%内生长,而在2.5%的NaCl浓度下,胞内的四氢嘧啶积累量达到最大值,为72.39mg/L。经过生物信息学分析:ectA、ectB和ectC基因位于Streptomyces pactum Act12中的同一个操纵子上,而大小分别为516bp、1272bp、399bp。预测ectA、ectB、ectC分别编码二氨基丁酸乙酰基转移酶(EctA)、二氨基丁酸氨基转移酶(EctB)、四氢嘧啶合成酶(EctC),其大小依次为18.8kDa(171 amino acid)、46.6kDa(423 amino acid)、14.9kDa(132 amino acid)。利用高保真酶Pfu克隆大小为2408bp的ectABC基因簇到表达载体pET-28a上并转化大肠杆菌BL21(DE3)。含pET28a-ectABC质粒的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中经0.5mmol/L IPTG在37℃诱导6h后,能够合成四氢嘧啶,但其盐耐受度未得到明显提高。四氢嘧啶合成的前体L-天冬氨酸-β-半醛,是由L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶(Aspartokinase;Ask)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate-semialdehyde dehydrogenase;Asd)催化下生成,Ask和Asd是四氢嘧啶合成的关键限速酶。在440种含有四氢嘧啶或羟基四氢嘧啶基因的微生物基因组中,只有约30%(132种微生物)在ectABC/D基因簇附近含有一个天冬氨酸激酶基因。在Act12全基因组中,Ask和Asd都是单拷贝,两者位置紧邻。本文将四氢嘧啶合成中的关键限速酶Ask和Asd在Streptomyces pactum Act12中过表达,以期提高Streptomyces pactum Act12的盐耐受度及四氢嘧啶的产量。