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第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定及其向胆碱能样神经元的诱导分化目的:从大鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并探讨其生物学特性。研究体外BMSCs向胆碱能样神经元诱导分化的情况。方法:采用全骨髓培养法体外分离培养获得大鼠BMSCs,根据培养细胞的贴壁能力进行纯化,相差显微镜下观察其形态变化,传至三代的细胞一部分进行CD71免疫荧光技术检测。另一部分细胞分为三组:诱导分化组,应用音猬因子(sonic hedgehog,Shh)、维甲酸(retinoic acid,RA)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对BMSCs进行诱导分化;自然分化组,加入1%血清自然分化;对照组,不加诱导因子,按前方法继续培养BMSCs。诱导72h后观察细胞形态变化并进行胆碱能神经元特异性标志物——胆碱能乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)免疫荧光技术检测。结果:原代培养的细胞形态多样,有大的扁平状细胞、蜘蛛状细胞和小的圆形细胞。经传代后,汇合细胞趋于一致,即小的成纤维样细胞和少数大的扁平细胞。培养至三代的细胞几乎都表达CD71,阳性率高达99%。诱导72h后,诱导分化组的细胞由小梭形状逐渐变为胞浆回缩,有细长突起的细胞。ChAT免疫荧光检测结果显示:诱导分化组ChAT阳性率约为15.8%;与其它两组相比有统计学差异。结论:经体外全骨髓分离培养由贴壁能力纯化的细胞呈均一性,几乎都表达CD71,证明培养的细胞为BMSCs。BMSCs有向胆碱能样神经元分化的潜能,Shh、RA和bFGF可以在体外诱导BMSCs向胆碱能样神经元的分化。第二部分Wnt3a在大鼠骨髓源性胆碱能样神经元中的表达目的:研究大鼠BMSCs诱导的胆碱能样神经元中Wnt3a的表达情况,探讨Wnt3a在BMSCs向胆碱能样神经元诱导分化过程中的可能作用。方法:体外分离培养的第三代BMSCs进行分组实验。实验共分三组:胆碱能样神经元诱导分化组,自然分化组和对照组。诱导72h后,分别提取各组细胞总RNA,应用半定量逆转录PCR(reverse-transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术分析Wnt3a在诱导前后细胞中的表达变化。结果用SPSS统计学软件进行分析。结果:Wnt3a在胆碱能样神经元诱导分化组中表达最高,与其他两组相比有统计学差异。在自然分化组和对照组中表达均低,相互之间比较没有统计学差别。结论:Wnt3a在BMSCs来源的胆碱能样神经元中高表达。Wnt3a可能参与了BMSCs向胆碱能样神经元的分化,其高表达可能促进BMSCs向胆碱能样神经元的分化。