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柑橘是我国重要的水果类作物,具有极高的经济价值。然而,在它的整个生命进程中会面临一些无法逃脱的环境因素,其中低温、干旱、盐渍等非生物胁迫严重危害其生长发育。为了抵御一系列因素带来的不良影响,植物往往会进化形成一套复杂且精准的环境应答机制,在这个信号传导系统中转录因子起着关键节点作用。AP2/EREBP家族是植物所特有的一类转录因子,其家族成员众多,广泛参与植物对低温、干旱、高盐等非生物胁迫的应答反应。‘龙回红’脐橙（Citrus sineses Osbeck cv.’Longhuihong’）是‘纽荷尔’脐橙（Citrus sineses Osbeck cv.’Newhall’）低温冻害选育的芽变品种,与‘纽荷尔’脐橙的遗传背景差异小,但抗逆性更强。本研究以‘龙回红’和‘纽荷尔’果实为材料,通过转录组测序,筛选到在‘龙回红’脐橙中基因表达显著上调的AP2/EREBP转录因子CsERF36和CsERF43。在分析甜橙AP2/EREBP家族转录因子进化关系的基础上,分别克隆了CsERF36和CsERF43基因序列并进行了亚细胞定位分析,从而明确了CsERF36和CsERF43基因的结构特点。进一步在拟南芥中异源超表达CsERF36和CsERF43,初步解析了两者的生物学功能,同时在锦橙中干涉CsERF36和CsERF43,该工作为后续深入研究CsERF36和CsERF43增强柑橘抗逆性提供了核心材料和前期基础。主要研究结果如下:1、全基因组测序结果表明‘龙回红’脐橙与‘纽荷尔’脐橙遗传水平相似度高达99.84%,进一步证明了‘龙回红’是‘纽荷尔’脐橙的芽变品种。转录组测序结果表明,在‘龙回红’和‘纽荷尔’果实中有99个基因的表达量差异倍数≥2倍,其中在‘龙回红’中上调的基因有53个,下调的基因有46个。转录因子CsERF36和CsERF43在‘龙回红’果实中表达量显著上调,分别为‘纽荷尔’果实的2.92倍和2.63倍。2、从甜橙全基因组范围内共鉴定到127个AP2/EREBP转录因子,与拟南芥AP2/EREBP转录因子的相似性在27.75%～88.89%之间。根据其在染色体上的位置分布,分别命名为CsERF1～CsERF127,其中大部分成员主要分布在chr1和chr5染色体上。启动子预测结果显示,该家族成员的启动子主要包括10类顺式作用元件,大部分元件与激素响应和逆境胁迫相关。通过分析蛋白序列发现,甜橙AP2/EREBP转录因子编码68～804个氨基酸,拥有1～29个外显子,62.20%的成员含有5’UTR和3’UTR;另外鉴定到20个保守Motif,其中AP2保守结构域主要包括Motif1/2/3/4。为了进一步预测各成员的功能,将127个甜橙AP2/EREBP转录因子和拟南芥AP2/EREBP转录因子共同构建NJ进化树,并将其分为27个亚族;其中CsERF36和CsERF43位于11亚族,在功能上与植物的物质合成和非生物应答相关。保守域结构分析结果表明,甜橙AP2/EREBP类转录因子中有41个高度保守的氨基酸残基,主要分布在3个区域,这3个区域中包含了3个β-折叠和一个α-螺旋。3、基于甜橙基因组数据库,从‘纽荷尔’和‘龙回红’中分别克隆得到CsERF36和CsERF43的CDS序列,测序结果表明两个基因在‘纽荷尔’和‘龙回红’中均没有差异;CsERF36和CsERF43的CDS长度为741 bp和600 bp,分别编码247和200个氨基酸,两者保守结构域的第14位氨基酸为缬氨酸,是CBF/DREB类转录因子,可以特异地与DRE元件结合。同时,亚细胞定位结果显示,CsERF43为定位在核的AP2/EREBP转录因子,而CsERF36在膜上和核上均有表达,可能为膜结合转录因子。4、通过在拟南芥中异源超量表达CsERF36,通过抗性筛选和PCR鉴定到6个T3代CsERF36超表达株系OE2、OE4、OE5、OE10、OE12和OE19。相比野生型而言,超表达植株的CsERF36表达量上调了2～284倍,其中OE10上调倍数最高。通过常规生理参数分析表明,OE10的发芽率显著高于野生型;OE10和OE12株系的根长显著高于野生型;OE5的叶绿素b含量显著低于野生型,而超表达植株的叶绿素a、叶绿素a+b含量与野生型植株无显著差异。进一步分析CsERF36超表达植株对Na Cl和ABA处理的响应能力。将萌发5 d的幼苗移入固体1/2 MS培养基中,200 m M Na Cl处理10 d后,部分野生型植株出现白化现象,而同一平板上的超表达植株OE2、OE5、OE10、OE12无白化现象,且表现出更强的生命力。拟南芥幼苗经过3μmol·L-1ABA处理10 d后,根系生长良好,但是新生叶表现出黄化症状,且CsERF36超表达植株和野生型植株的表型无显著差异,表明超量表达CsERF36不能改变植株对ABA的敏感性。此外,超表达植株和野生型植株经过低温处理（-1℃）,在第0 d、第2 d和第4 d两者相对电导率和MDA含量均显著升高,但两者间无显著差异,目前未观察到超量表达CsERF36提高拟南芥在-1℃的耐冻性。对OE2、OE4、OE10三个超表达株系及野生型植株进行干旱处理和复水处理,未观察到植株间的表型差异,在拟南芥中超量表达CsERF36不能提高植株的耐旱性。此外,目前已获得了CsERF43的T2代种子,为后续研究提供了重要材料。5、构建pGN-RNAi-CsERF36和p GN-RNAi-CsERF43干涉载体转化锦橙上胚轴,通过共培养、筛选培养得到抗性芽,经GUS染色鉴定后,将得到的阳性小芽放置于芽增殖培养基中培养,待芽长到3 cm左右时,用于生根培养。