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结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,其发病率高,死亡率高,严重威胁国民健康。结直肠癌起病隐匿,早期症状不典型,许多患者就诊时已发生转移。合并转移的结直肠癌患者预后不良,1年相对生存率为52.6%,2年相对生存率仅为33.3%。结直肠癌目前主要的治疗方式为手术切除和放化疗。这些治疗手段一般初期疗效较好,但经过数月至数年的缓解后,约30-50%的患者病情进展,发生肿瘤侵袭和转移。而结直肠癌患者的主要死亡原因正是侵袭和转移。因此,防治肿瘤进展(主要表现为侵袭和转移)是提高患者生存率的重要手段。肿瘤进展是一个复杂的过程,受多种因素的调控,目前认为上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)与肿瘤转移密切相关。肿瘤DNA倍体异常是肿瘤进展及恶性度的标志。上皮-间质转化是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的过程。EMT涉及Snail、Slug、Twist等一系列多能转录因子的变化,这些变化引起细胞粘附分子(如E-钙粘蛋白)表达的减少,基质降解酶表达的增加,细胞运动性的增加和对凋亡抗性的提升,从而使细胞获得较高的侵袭与迁移能力。EMT被认为是上皮细胞来源的恶性肿瘤发生转移的重要生物学过程。肿瘤干细胞近年来倍受关注,该模型认为肿瘤内部存在遗传异质性,只有肿瘤干细胞具备无限增殖和独立成瘤的特性,是肿瘤发生转移的重要原因。而激活EMT程序是产生肿瘤干细胞的主要机制,两者联合促进肿瘤的转移。染色体不稳定性(Chromosomal instability,CIN)是肿瘤细胞基因不稳定性的一种表现形式,可导致肿瘤细胞染色体数目异常,形成非整倍体。在肿瘤的发生、发展中,染色体不稳定性可以促使肿瘤细胞发生突变,转化为更具侵袭性或者耐药的表型。目前,非整倍体被认为是肿瘤进展及恶性度的标志,在结直肠癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤中提示预后不良。在肿瘤的发生、发展过程中,肿瘤细胞常常涉及到一系列胚胎基因及原癌基因的过表达,其中包括肿瘤/睾丸抗原(Cancer/testis antigens,CTAs)。有研究表明CTAs在多种肿瘤中存在异常表达,并且与患者的不良预后相关,在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。多种CTAs如SSX、CAGE、piwil2和CT45A1,可上调EMT和肿瘤转移相关基因,促进EMT和肿瘤扩散;某些CTA,包括Piwil2、DNAJB8、CT45A1、MAGE-A、CAGE和SPANX在肿瘤干细胞的发生和维持方面有重要作用。REC8为减数分裂时特异表达的黏连蛋白成分,在维持着丝粒黏连素和保证染色体正确分离中起着非常重要的作用。作为CTAs成员之一,REC8在不同肿瘤中的表达及作用不同。REC8在甲状腺癌中表达减低,上调其表达可以抑制甲状腺癌细胞增殖及克隆形成。而其在皮肤T细胞淋巴瘤中表达却是升高的。目前,REC8在结直肠癌中的作用尚不明确。目的:明确REC8在结直肠癌中的表达及其与患者临床特征的关系,研究其对结肠癌细胞系HCT116及SW480增殖及转移的影响,并进一步探讨其分子机制,为发展以REC8为靶点的结直肠癌治疗提供理论依据。方法:从河北医科大学第二医院收集30对手术切除的新鲜结直肠癌及其癌旁组织标本。应用Western blotting及免疫组织化学技术(IHC)检测结直肠癌及癌旁组织中REC8的表达情况并进行量化分析,用Fisher确切概率法分析其与临床病理特征的关系。在结肠癌细胞系HCT116和SW480中转染带FLAG标签的FLAG-REC8融合蛋白真核表达质粒(FLAG-REC8),以不含REC8编码序列的FLAG空载体(FLAG)为对照,应用Western blotting鉴定过表达效果,观察肿瘤转移相关蛋白MMP-9、VEGF-C及增殖标志PCNA蛋白水平,判断REC8对细胞增殖及侵袭迁移的影响;观察EMT相关蛋白Snail、CDH1及CSCs标志物CD133、CD44的表达水平,明确REC8对EMT及CSCs形成的作用。应用流式细胞术观察结直肠癌及癌旁组织的DNA倍体情况,进一步在结肠癌细胞系HCT116中转染FLAG-REC8质粒,检测细胞的倍体情况。结果:1 REC8在结直肠癌组织中的表达Western blotting及免疫组织化学技术(IHC)结果显示,REC8在结直肠癌组织及其配对癌旁组织中的表达水平无显著差异(P=0.066,P=0.761)。2 REC8表达水平升高与结直肠癌患者的淋巴结转移相关Western blotting结果显示,在合并淋巴结转移的结直肠癌患者中,有64%(7/11)的患者癌组织中REC8表达水平高于其癌旁组织,而在无淋巴结转移的结直肠癌患者中,仅有5%(1/18)的患者癌组织REC8表达水平升高。REC8表达上调与患者淋巴结转移(P=0.001)和AJCC分期(P=0.003)相关,而与患者的年龄(P=0.422)、肿瘤的位置(P=0.431)以及肿瘤的浸润深度(P=0.148)无关。IHC检测结果显示,在合并淋巴结转移的患者中,有82%(9/11)的患者癌组织REC8表达水平升高,而在无淋巴结转移的患者中,有33%(5/15)的患者癌组织REC8表达升高。REC8表达上调与患者淋巴结转移相关(P=0.021)。以上结果表明,在结直肠癌发展过程中,癌组织中REC8表达升高与结直肠癌患者的淋巴结转移相关。3 REC8上调结肠癌细胞转移相关蛋白表达Western blotting结果显示,在结肠癌细胞系HCT116和SW480中,过表达REC8可促进转移相关蛋白MMP-9(P=0.016,P=0.017)及VEGF-C(P=0.013,P=0.009)的表达。表明REC8可增强结肠癌细胞的侵袭及转移能力。4 REC8不影响结肠癌细胞的增殖能力Western blotting结果显示,在结肠癌细胞系HCT116和SW480中,过表达REC8组PCNA的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P=0.12,P=0.492),表明REC8并不影响肿瘤细胞的增殖。5 REC8促进结肠癌细胞发生EMT及CSCs的形成Western blotting结果显示,在结肠癌细胞系HCT116和SW480中,过表达REC8可上调EMT转录因子Snail(P=0.012,P=0.016)的表达,并下调其下游负调节靶分子CDH1(P=0.022,P=0.043)的表达,同时促进肿瘤干细胞标志物CD133(P=0.004,P=0.012)及CD44(P=0.041,P=0.007)的表达。以上结果表明,REC8可促进结肠癌细胞发生EMT,同时促进CSCs的形成,导致细胞的侵袭及转移能力增强,从而促进结直肠癌的转移。6 REC8表达水平升高增加结直肠癌的染色体不稳定性流式细胞术结果显示,所有的非整倍体结直肠癌组织,REC8表达水平均升高(100%,6/6),在二倍体的结直肠癌组织中,40%(8/20)的癌组织REC8表达水平升高。癌组织REC8表达水平升高与结直肠癌非整倍体相关(P=0.017);在结肠癌细胞系HCT116中转染带FLAG标签的FLAG-REC8融合蛋白真核表达质粒(FLAG-REC8),以不含REC8编码序列的FLAG空载体(FLAG)为对照,应用流式细胞术检测细胞的倍体情况,结果显示,过表达REC8可以增加结肠癌细胞HCT116 DNA含量,形成异倍体(P=0.001)。以上结果表明,REC8可增加结直肠癌的染色体不稳定性。结论:1在结直肠癌发展过程中,REC8表达水平升高与结直肠癌患者的淋巴结转移相关。2 REC8增强结肠癌细胞侵袭及转移能力。3 REC8促进结肠癌细胞发生EMT及CSCs的形成。4 REC8增加结直肠癌的染色体不稳定性。