猪是流感病毒发生重配的“混合器”以及产生流感病毒新毒株的“孵育器”,因而猪在流感病毒种间传播中扮演重要角色,因此防止流感病毒在猪群中的传播具有很重要的公共卫生意义。天然免疫系统是机体抵御外界病原感染的非特异性防御系统,宿主是否发病取决于病原感染和机体防御相互作用的结果,防御能力较强的猪便表现出天然的抗病力。因此,从遗传本质上提高猪对猪流感等病毒的抗病能力,筛选和培育具有抗流感病毒的动物品系,是防控流感病毒的治本之策。而获得有效的抗病候选基因是开展抗病育种工作的重中之重。同时,流感病毒为了有效的感染宿主会采取各种策略拮抗宿主的抗病毒防御应答,尤其是干扰素介导的天然免疫应答。热休克蛋白27(HSP27)是一种细胞内广泛表达的小热休克蛋白。病毒感染宿主细胞几乎都会诱导HSP27的高度表达,但是其在病毒感染中的作用仍不清楚。同时,有研究表明,HSP27能够参与调节细胞信号转导通路,包括NF-κB介导的炎症应答通路,但其在宿主干扰素信号通路中的功能尚不清楚。因此,本研究首先以猪转录组芯片-生物信息学为平台初步筛选流感病毒感染猪诱导表达的基因,通过过表达和沉默技术检测这些基因对流感病毒增殖的影响,并对抗病毒效果显著的基因进行深入的机制探索。同时,我们还研究HSP27蛋白对病毒增殖的影响以及HSP27对天然免疫信号信号通路的调控,揭示HSP27在病毒感染以及调控天然免疫信号通路中的功能和机制。主要研究结果如下:1猪肺组织转录组芯片和生物信息学分析对H1N1感染猪肺组织基因芯片进行分析,发现病毒感染后3d和7d分别有214个和268个差异表达基因。感染后3d的差异基因主要参与免疫应答、信号转导、炎症应答以及发育等,其中最显著特征的是干扰素诱导基因的广泛表达。感染后7d的差异基因主要与信号转导、代谢以及转录等功能相关。Pathway分析显示感染后3d主要的信号通路为细胞粘附,细胞因子与受体互作,Toll样受体通路和MAPK通路等;7d则是PPAR通路和补体与凝血通路等。2候选基因克隆、表达以及对猪流感病毒增殖影响为了验证干扰素信号通路接头分子以及干扰素诱导基因对流感病毒增殖的影响,我们首先从poly(I:C)处理过的PAM细胞克隆了 35个相关基因。过表达实验显示,干扰素信号通路分子,如TBK1和IRFs对病毒增殖抑制效果非常明显;干扰素诱导基因,如IFITs以及GBPs也有显著的抗病毒效应,但比干扰素接头分子抗病毒活性弱。此外,我们还发现猪宿主防御肽PAMP23和PG4能显著抑制禽流感病毒的复制,并且呈现明显的剂量依赖性。PG4的抗流感病毒能力优于PMAP23,在在高浓度条件下能够大大抑制H5N1病毒增值。有趣的是,我们还发现IRF1的具有很强抗病毒能力,可以降低病毒滴度100倍左右,甚至优于IRF3的抗病毒效应。进一步研究发现IRF1显著增强VISA诱导的IFN-β-luc、ISRE-luc以及NF-Kb-luc活性。3 GBP1抗流感病毒增殖的机制GBP1是受IRF1调控的一个重要的基因,过表达GBP1对猪流感病毒、人流感病毒以及猪源H5N1病毒都有很好的抑制作用,同时,GBP1对猪流感病毒三种形式的RNA都有很显著的抑制能力。相反,沉默GBP1显著提高病毒在PK-15细胞上的增殖滴度。同时还发现,猪GBP1的抗病毒功能取决于其N端GTPase功能域,并且依赖于N端的47和48位GTP结合位点。此外,猪GBP1能显著降低流感病毒聚合酶活力,还与流感病毒NP和NS1蛋白互作,并且GBP1与NP在核周围存在共定位现象。4 HSP27对流感病毒增殖的影响H5N1病毒感染A549诱导HSP27早期上调表达,24h后下调表达。过表达HSP27显著促进H5N1病毒的增殖,在感染后36h,HSP27过表达的细胞病毒滴度是对照细胞病毒滴度的10倍左右。同时,过表达HSP27还能促进VSV病毒的增殖,说明HSP27的功能并不具有病毒特异性。相反,敲除HSP27后病毒增殖滴度显著下降。由此可见,HSP27是病毒复制周期中的一个必需的宿主因子。5 HSP27对干扰素信号通路的影响启动子报告实验发现,过表达HSP27显著抑制仙台病毒以及RIG-I,MDA5,VISA,TBK1和IKKi等信号分子诱导的干扰素启动子的活性,以及降低VISA和TRIF蛋白诱导的IRF3磷酸化水平。相反,沉默HSP27增强上述干扰素接头分子诱导的干扰素启动子活性。同时,还发现HSP27能够通过IRF3和NF-κB两条路径负调控Ⅰ型干扰素信号转导。而且,我们还发现,在病毒感染细胞的早期,HSP27存在由胞浆向线粒体转移的现象。6 HSP27对调控干扰素信号通路的机制研究通过免疫共沉淀实验,我们发现HSP27与VISA,TRAF3和TRAF6存在相互作用关系,并导致TRAF3和TRAF6蛋白的降解。泛素化实验实验发现HSP27能够通过K48位连接的泛素化途径降解TRAF3和TRAF6蛋白,进而抑制了 IRF3和NF-κB介导的干扰素的产生。HSP27的负调控干扰素的功能依赖于其82位氨基酸的磷酸化。