作为人类基因组复杂的遗传变异,拷贝数变异(copy number variation, CNV)在研究疾病方面有重大的意义。目前,现行CNV分析检测技术大多已商品化,成本高且对实验仪器依赖性较大。本文建立并优化了一种基于通用荧光引物的多重竞争性PCR技术。通过调节引物的退火温度,PCR反应被分两个阶段进行。在前10个循环中,嵌合特异引物引导了DNA模板的扩增,而在接下来的循环过程中,通用荧光引物取代嵌合特异引物完成整个PCR反应。PCR产物经ABI3730型测序仪分离检测并获取峰值。通过比较对照样本和待测样本标化后的峰值,来检测待测样本目标区段的拷贝变化。其中,通用荧光引物降低了实验成本,等比例扩增所有的检测位点,大大降低了多重PCR的复杂性,从而易于实现了CNV的定量检测。本文还提出了新的内对照制备方案。该方案的内容为：利用PCR反应,在目标区段引入2bp碱基的插入或缺失；PCR产物被克隆到T载体中；克隆质粒经验证无误后,被大量抽提；质粒经酶切后,可作为内对照使用。内对照首次制备时稍显繁琐,但一经制备即可长期使用,无需重复构建。该方案操作简单、经济且易于实现。本实验针对3只小鼠(ZJY-1、ZJY-2、ZJY-3)的转基因区段,设计了3个检测位点,并利用该技术对3个位点进行了检测。结果显示ZJY-1、ZJY-2和ZJY-3的目标区段分别为四拷贝、三拷贝和五拷贝。其检测结果与real-time qPCR的结果一致。实验结果同时表明该技术有很高的灵敏度,可以在5个拷贝的范围内检测单拷贝的变化。该技术具有一定检测通量(5～25个位点),可以满足一般实验要求。随后,对一些可影响实验精确的因素进行了研究。这些因素主要包括：内对照的形态、2bp的序列的差异,PCR体积、待测样本和内对照初始模板的相对量、通用引物添加与否、荧光信号强度与PCR产物量间产函数关系。研究结果表明当内对照与待测样本具有相似的空间结构时两者具有相似的扩增效率；当内对照初始模板量相对待测样本较高时,拷贝数检测结果整体偏低,而当两种模板相对量差异或待测样本初始模板量偏高时,拷贝数检测结果准确；PCR反应体积过小会影响实验结果。同时实验数据表明荧光信号强度与PCR产物量可以近似看作正比关系。荧光信号的强度可以直接用于分析CNV,而无需经由公式校正。而其他因素对实验结果没有明显影响。