论文部分内容阅读
目的通过观察针刺大鼠血清对离体培养的SD大鼠乳鼠成骨细胞OPG、RANKL mRNA和蛋白表达的影响,探究针刺对骨代谢信号通路OPG/RANKL/RANK的作用,以期为针刺治疗骨质疏松症提供理论基础。方法将60只SPF级雌性SD大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、药物组、针刺组,每组12只。空白组不予任何处理;假手术组只切开暴露双侧卵巢,但不摘除;模型组、药物组、针刺组均采用外科手术摘除其双侧卵巢,饲养3个月后检测骨密度和骨矿物含量。空白组不予任何治疗方法,正常饲养;模型组、假手术组除灌服与药物组相同体积的蒸馏水外,正常饲养;药物组以1mL/100g标准灌胃给予0.02mg/mL戊酸雌二醇片水溶液;针刺组选取穴位“三阴交”,“足三里”,“脾俞”,“肾俞”针刺,接入电针30min,同时灌服与药物组同体积的蒸馏水。1次/d,连续治疗5d,间隔2d,20d为1疗程。治疗3疗程后检测各组大鼠全身骨密度,判定治疗效果。随后,麻醉大鼠,经心脏部位采血。血液经4℃冷置1h、离心(2500r/min,25min)、56℃水浴灭活、0.22um滤网抽滤除菌,得到效应血清。取10只出生2d内的SD大鼠乳鼠,分离颅骨后采用胶原酶消化法分离得到成骨细胞。原代成骨细胞进行爬片培养24h后,将效应血清以10%的比例(效应血清:成骨细胞培养基=1:10)加入其中。培养3d后,以4%的多聚甲醛(原位杂交爬片采用含有1/1000 DEPC的多聚甲醛)固定各组爬片。成骨细胞内OPG、RANKL mRNA的表达量采用原位杂交法检测;成骨细胞内OPG、RANKL蛋白的表达量采用免疫细胞化学染色法检测。结果1.SD大鼠切除双侧卵巢饲养3个月后,全身骨密度检测结果发现,去卵巢大鼠全身骨密度和骨矿物含量均显著低于空白组(P<0.01),证明骨质疏松症模型建立成功。当治疗3个疗程后,针刺和药物治疗均显著提高了大鼠全身骨密度和骨矿物含量,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01),其中以针刺治疗效果好。2.成骨细胞内OPG原位杂交检测结果:与空白组相比,模型组OPG mRNA表达量显著下降(P<0.01);与假手术组相比,模型组OPG mRNA表达量显著降低(P<0.01);经过药物或针刺处理后,OPG mRNA表达量显著升高,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。3.成骨细胞内RANKL原位杂交结果:与空白组相比,模型组RANKL mRNA表达量显著升高(P<0.01);与假手术组相比,模型组RANKL mRNA表达量显著上升(P<0.01);经过药物或针刺处理后,RANKL mRNA表达量显著降低,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。4.成骨细胞内OPG免疫细胞化学染色结果:与空白组相比,模型组OPG蛋白表达量显著下降(P<0.01);与假手术组相比,模型组OPG蛋白表达量显著降低(P<0.01);经过药物或针刺处理后,OPG蛋白表达量显著升高,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。5.成骨细胞内RANKL免疫细胞化学染色结果:与空白组相比,模型组RANKL蛋白表达量显著升高(P<0.01);与假手术组相比,模型组RANKL蛋白表达量显著上升(P<0.01);经过药物或针刺处理后,RANKL蛋白表达量显著降低,与模型组相比具有统计学意义(P<0.01)。结论针刺治疗能够显著提高大鼠全身骨密度和骨矿物含量,同时针刺大鼠效应血清能够明显提高成骨细胞内OPG mRNA,蛋白的表达量;同时,亦能降低成骨细胞内RANKL mRNA,蛋白的表达量。本研究提示针刺能够通过调节骨质疏松症模型大鼠OPG、RANKL mRNA和蛋白的表达量,即调节OPG/RANKL/RANK信号通路达到平衡,从而间接影响成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收环节,达到治疗骨质疏松症的效果。