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背景: 肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的癌症之一,而且肺癌已取代肝癌,成为我国恶性肿瘤死亡的首位原因,每年因肺癌死亡的人数达140万左右.肺癌中晚期的治疗成本高且效果差,化疗是其主要的治疗手段,而且生存率极低.所以寻找具有特异靶向性且高效杀死肿瘤细胞的治疗方法是非常必要的. 目前新型疗法的效果只能通过忠实的重述人类疾病的临床前模型系统才能实现,所以动物模型在肺癌治疗的研究中必不可少,而治疗效果的传统评价方法必须要处死动物,并且无法纵向研究整个治疗过程,所以,寻找一种监测肺癌治疗效果的新型方法十分重要. 生物发光成像技术(bioluminescent imaging,BLI)是一种非侵入性的实时可视化成像模型,可以在细胞、分子或基因水平上测量生物体内的生理或病理变化.近几年,因其具有特异性高、灵敏度高、无创、适合长期监测等优点,BLI作为一种新的检测方法在药物研发和肿瘤治疗等方面发挥重要作用. 纳米载药体系是当今治疗研究的热点,纳米材料具有体积小、表面积大等诸多特殊理化性质,可携载多种生物分子穿越生物屏障,高效率的输送到靶器官及细胞内.利用明胶修饰的单臂碳纳米管(Gel@SWCNTs)作为纳米材料,包载SA-mGM-CSF或DOX形成Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系(NPS),该纳米载药体系可对近红外光(NIR)响应,我们基于生物发光成像技术在细胞水平和动物水平监测纳米载药体系对小鼠肺癌的治疗效果. 目的: 1 、构建稳定表达荧光素酶的小鼠肺癌细胞株Lewis-Luc. 2 、构建小鼠肺癌原位模型. 3 、体外验证Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系对Lewis-Luc细胞的毒性作用. 4 、基于生物发光成像监测Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系对小鼠肺癌的治疗效果. 方法: 1、构建pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒. 运用 PCR 对目的基因Luc2GFP进行扩增,用 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ对pLVX-EF1a-IRES-Puro载体进行双酶切,再利用 ClonExpressTM Ⅱ One Step Cloning Kit(一步法定向克隆无缝克隆试剂盒)对载体和目的片段进行一步连接和转化,获得pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒. 2、获得稳定表达荧光素酶的小鼠肺癌细胞株Lewis-Luc. 通过构建的pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒转染293T细胞,制备所需的慢病毒.用制备的慢病毒感染Lewis细胞.流式细胞术单细胞分选获得Lewis-Luc单克隆.并通过细胞成像、流式细胞术、蛋白印迹、免疫荧光等技术来评估荧光素酶和绿色荧光蛋白的稳定表达. 3、建立小鼠Lewis-Luc肺癌原位模型:将100ul 1×105/ml Lewis-Luc细胞悬液注射于C57BL/6小鼠肺部,构建小鼠肺癌原位模型. 4、体外验证Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系对Lewis-Luc细胞的毒性作用:将不同浓度的纳米载药体系与Lewis-Luc 细胞共培养24h,加荧光素底物后用酶标仪检测细胞存活率. 5、基于生物发光成像技术监测Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系对小鼠肺癌的治疗效果:当小鼠肺部肿瘤长至利用生物发光成像技术能够检测到时,将小鼠随机分为5组(n=5),包括PBS+NIR组、Gel@SWCNTs+NIR组、Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF+NIR组、Gel@SWCNTs-DOX+NIR组、Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF+NIR组.荷瘤小鼠眼眶静脉注射治疗材料30min后,进行近红外光(NIR)激光(808nm,1W/cm2,5mm)照射2 min,照射过程中用红外测温仪监测肿瘤部位温度.共治疗4次,每8天治疗一次.治疗后每2天称量小鼠体重,每7天生物发光成像监测肿瘤大小,评估治疗效果.4次治疗后,第30天,取小鼠脾、肺组织用流式细胞术检测免疫细胞的变化. 结果: 1、成功构建pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒. 用Not Ⅰ和EcoR Ⅰ对质粒进行双酶切,用1%的琼脂糖凝胶检测结果,成功得到与预期条带大小一致的片段. 2、成功获得稳定表达荧光素酶的小鼠肺癌细胞株Lewis-Luc. 用构建的pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro质粒转染293T细胞,成功制备所需的慢病毒.用制备的慢病毒感染Lewis细胞.流式细胞术单细胞分选成功获得Lewis-Luc单克隆.荧光显微镜下观察到细胞表达GFP.通过细胞成像证明荧光素酶的表达,流式细胞术证明GFP的表达,蛋白印迹和免疫荧光证明荧光素酶和GFP的表达,体外实验证明荧光素酶和GFP的稳定表达. 3、体外验证Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系对 Lewis-Luc 细胞的毒性作用:DOX的半数致死浓度(IC50)约为12.5μg/ml,而Gel@SWCNTs-DOX的IC50约为25μg/ml,且Gel@SWCNTs的IC50约为25μg/ml,Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF和Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的IC50为50μg/ml.结果说明Gel@SWCNTs及其包载SA-mGM-CSF和DOX后,与DOX相比,具有低毒性和生物相容性好的优点. 4、基于生物发光成像技术监测Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF/Gel@SWCNTs-DOX/Gel@SWCNTs-DOX-SA-mGM-CSF的纳米载药体系对小鼠肺癌的治疗效果:治疗后Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF组较PBS对照组小鼠生存期延长,生物发光成像监测肿瘤生长减慢,说明Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF组对小鼠肺癌有一定的治疗效果. 结论: 本课题成功构建稳定表达荧光素酶的小鼠肺癌Lewis-Luc细胞株,基于生物发光成像技术在细胞水平和动物水平监测纳米载药体系对小鼠肺癌的治疗效果.结果表明,治疗后Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF组较PBS对照组小鼠生存期延长,肿瘤生长减慢,说明Gel@SWCNTs-SA-mGM-CSF组对小鼠肺癌有一定的治疗效果.