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研究背景急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是异基因造血干细胞移植后的严重并发症,是造成患者移植后死亡的重要原因。目前临床试验研究表明间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)在急性移植物抗宿主病的预防和治疗中发挥一定作用,但其应用仍存在一定争议,因此寻找提升间充质干细胞免疫调节能力的新方法有望增强间充质干细胞在预防和治疗急性移植物抗宿主病中的作用。研究目的探究程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)基因修饰的MSC对免疫效应细胞的抑制作用,为进一步用于临床预防和治疗aGVHD奠定基础。研究方法和结果1.体外培养和鉴定人脐带MSC。镜下观察MSC呈纺锤形,具有贴壁、涡旋状排列生长的特性;流式结果显示,本研究中使用的MSC细胞表面CD11b、CD19、CD34、CD45和HLA-DR 阳性率在2%以下,CD73、CD90和CD105阳性率在99%以上;成脂肪诱导后油红O染色可检测到细胞内的脂肪,成骨诱导后定量PCR(qPCR)可检测到成骨标志性基因RUNX2和Osteocalcin(OC)在mRNA水平表达的升高。2.过表达PD-L1对人脐带MSC免疫调节作用的影响。腺病毒感染MSC进行PD-L1基因修饰后,流式可检测到MSC表面PD-L1的表达随着MOI的增加逐渐升高;通过cck-8法检测增殖、流式检测细胞凋亡和表面标志,我们发现过表达PD-L1不改变MSC的细胞形态、增殖能力、凋亡情况以及细胞表面标志;利用植物血球凝集素(phytohaemagglutinin,PHA)刺激人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),将MSC与人外周血单个核细胞共培养,CFSE染色后流式检测T淋巴细胞增殖和激活标志物CD25、CD69阳性细胞的水平,我们发现①当MSC与PBMC共培养的比例为1:5或1:10时,与PD-L1基因修饰的MSC共培养的CD3+T淋巴细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞增殖能力显著下降(1:5,CD3+T细胞数量486 vs 310 p=0.007,CD3+CD8+T 细胞数量 249 vs 102 p=0.001,CD3+T 细胞增殖指数 1.72 vs 1.10 p=0.005,CD3+CD8+T 细胞增殖指数 2.37 vs 1.26 p=0.005;1:10,CD3+T 细胞数量 1015 vs 671 p=0.014,CD3+CD8+T 细胞数量 521 vs 245 p=0.002,CD3+T 细胞增殖指数 1.16 vs 1.05 p=0.005,CD3+CD8+T 细胞增殖指数 1.95 vs 1.26 p=0.002)②当 MSC 与 PBMC共培养的比例为1:10时,CD3+CD8+T淋巴细胞的激活水平显著降低(CD25 阳性细胞数量 13 vs4p=0.019,CD25 阳性细胞比例 4.07%vs 1.13%p=0.039)。3.人脐带MSC中PD-L1的表达调控机制研究。干扰素γ(Interferonγ,IFN γ)刺激后 qPCR 法检测 MSC 中 PD-L1 以及 Aire、HIF1 α、IRF1、STAT3、NFκB 和 A20等基因mRNA表达水平的变化,我们发现IFN γ刺激后PD-L1表达显著升高的同时,IRF1、STAT3、NFκB和A20的表达水平也显著升高,其中IRF1升高的幅度最大(最高可达70倍以上);通过脂质体转染siRNA敲低IRF1的表达,qPCR检测IRF1和PD-L1 mRNA表达水平,我们发现敲低IRF1后PD-L1的表达也随之降低,其中150nM siRNA加 30ng/mlIFN γ 刺激 20h 条件下的结果最明显(IRF1 1 vs 0.68 p<0.001,PD-L11 vs 0.53 p=0.001);另一方面,通过慢病毒感染过表达IRF1,qPCR检测IRF1和PD-L1 mRNA表达水平,我们发现过表达IRF1可导致PD-L1表达的升高(IRF1 1 vs 30.80 p=0.018,PD-L1 1 vs 10.87 p=0.009)。研究结论1.本研究中使用的人脐带MSC状态良好,在生长特性、表面标志和成脂肪、成骨分化能力上符合目前的国际鉴定标准;2.PD-L1基因修饰可增强人脐带MSC对T淋巴细胞激活和增殖的抑制作用;3.在人脐带MSC中,IRF1参与了 PD-L1的表达调控。