环氧烷胺衍生物修饰siRNA负载脂质体的肺部给药研究

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目的:制备负载Survivin si RNA、MRP1 si RNA的新型类脂质体用于肺部给药,与抗癌药物顺铂联用逆转肿瘤耐药性,考察该给药系统对于si RNA的递送能力。方法:合成三种具有不同碳链长度和氨基结构的环氧烷胺衍生物EAADs(Epoxy Alkyl Amine Derivative Lipidoids,EAADs),采用1H-NMR、FT-IR进行结构表征。采用乙醇注入法制备EAADs、PEG-EAADs和EGFR m Ab-PEG-EAADs类脂质体,通过流式细胞仪和共聚焦显微镜观察其在A549/DDP细胞中的摄取和分布情况,喷雾冷冻干燥法制备成干粉吸入剂。以顺铂为抗癌药物,采用负载Survivin si RNA和MRP1si RNA的EAADs类脂质体转染A549/DDP细胞后,MTT法检测该细胞对顺铂的敏感性,Western Blot法检测Survivin蛋白和MRP1蛋白表达情况,Annexin V-FITC/PI双染法和碘化丙啶(PI)法分别检测A549/DDP细胞给予Survivin si RNA后的凋亡及周期变化情况。采用IVIS LuminaⅡ小动物活体成像仪观察静脉注射和肺部吸入给药时负载Cy5-si RNA的EAADs类脂质体在裸鼠体内的分布情况。在Luci-A549原位肺癌模型上通过小动物活体成像仪监测肿瘤生长情况以考察负载Survivin si RNA和MRP1si RNA的EGFR m Ab-PEG-EAADs类脂质体与顺铂联用时在裸鼠身上的抗肿瘤效果。最后进行相关指标的血液生化学分析以及对肺组织HE染色进行病理观察。结果:EAADs类脂质体外形圆整、粒径在200 nm左右,载体安全性良好,对si RNA具有较好的保护作用,满足给药需求。喷雾冷冻干燥法制得的干粉吸入剂物理粒径为11.90±0.57μm、空气动力学粒径为2.45μm、引湿性为6.64±1.12%。该法制得的干粉具有多孔低密度特征,空气动力学粒径符合肺部给药要求。EAADs-3类脂质体在A549/DDP细胞上的摄取明显高与EAADs-1和EAADs-2类脂质体,PEG修饰后摄取率增加,且EGFR m Ab-PEG-EAADs-3类脂质体更倾向于定位在A549/DDP细胞的细胞质中。EGFR m Ab-PEG-EAADs-3类脂质体在A549/DDP-Raw264.7共培养体系中主要能够选择性的进入A549/DDP细胞。通过Western Blot法筛选出高沉默效率的Survivin si RNA序列和MRP1 si RNA序列,以EAADs-3、PEG-EAADs-3和EGFR m AbPEG-EAADs-3类脂质体作为转染试剂将Survivin si RNA(或MRP1 si RNA)转染进A549/DDP细胞后,A549/DDP细胞对顺铂的敏感性提高,相应蛋白的表达量下降,此外转染Survivin si RNA后的细胞凋亡率上升,G2期延长。体内分布结果显示雾化吸入以及干粉吸入EAADs类脂质体相对于静脉注射给药能延长药物在肺部的滞留时间。体内抗肿瘤结果显示联合使用Survivin si RNA、MRP1 si RNA和DDP组肿瘤抑制要强于单独使用DDP组,肝肾功能没有明显损伤。结论:EGFR m Ab-PEG-EAADs-3类脂质体具有良好的递送基因药物的潜力,有望通过肺部给药给予相关si RNA,逆转肿瘤耐药性,增强顺铂的治疗效果。
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