萆薢总皂苷抗炎镇痛作用及对cPLA2/COX信号通路的影响

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目的:建立粉萆薢总皂苷(Total Saponin of Dioscorea,TSD)提取工艺,测定TSD和薯蓣皂苷的含量;研究TSD抗炎镇痛作用、对小鼠皮下气囊炎症及其胞浆磷脂酶A2(cytosolic phospholipases A2,c PLA2)/环加氧酶(cyclooxygenase,COX)信号通路的影响。方法:1.乙醇回流法提取TSD,以薯蓣皂苷元为对照品,高氯酸为显色剂,紫外-可见分光光度法测定TSD含量(测定波长409±1 nm);以薯蓣皂苷为对照品,HPLC法测定其中薯蓣皂苷含量(C18色谱柱4.6 mm×250 mm,5μm,流动相为甲醇和水,梯度洗脱,检测波长为208 nm)。2.尿酸钠(monosodium urate,MSU)致大鼠急性痛风性关节炎模型,观察大鼠步态、测量关节肿胀程度,ELISA法检测关节浸出液炎性因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(Interleukin-18,IL-18)水平,并进行关节组织病理学检查。醋酸和热板法分别致小鼠疼痛模型,观察小鼠扭体反应和痛阈。3.60只KM雄性小鼠,随机分为正常组、模型组、TSD高、中和低剂量(600、200、60 mg/kg.d)组和地塞米松组(0.30 mg/kg.d)。背部注入尿酸钠复制小鼠皮下气囊炎症模型,造模1 h后灌胃给药,每天2次,连续2 d,收集气囊灌洗液,测定渗出液量、白细胞数、IL-1β和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平;RT-PCR检测气囊内衬组织c PLA2、COX-1和COX-2 m RNA的表达,Western Blot法和免疫组化技术检测气囊组织c PLA2、COX-1和COX-2蛋白表达。结果:1.TSD提取工艺为10倍量95%乙醇回流提取3次,每次1 h;等量石油醚脱脂,水饱和正丁醇萃取2次,薯蓣皂苷元线性范围为25.4~152.4μg(r=0.9992),平均回收率为99.39%(RSD=1.62%)。薯蓣皂苷与其他成分分离良好,峰面积与浓度呈良好的线性关系,线性范围为1.0~8.0μg(r=0.9994),平均回收率为99.22%(RSD=1.56%)。三批粉萆薢药材提取物中的总皂苷的含量分别为61.74%、58.78%和60.47%,薯蓣皂苷的含量分别为33.9%、33.15%和32.26%。2.TSD能明显降低急性痛风性关节炎大鼠关节肿胀度,降低关节浸出液中IL-1β和IL-18水平(P<0.01或P<0.05),减轻关节病理学炎症,显著提高热板法小鼠痛阈值,减少醋酸诱导的小鼠扭体次数(P<0.01或P<0.05)。3.在小鼠皮下气囊炎症模型,与正常组比较,模型组小鼠气囊渗出液量、白细胞数、PGE2和IL-1β水平显著升高(P<0.01或P<0.05),气囊组织中c PLA2、COX-1和COX-2 m RNA和蛋白表达显著上调(P<0.01或P<0.05)。与模型组比较,TSD高、中和低剂量组和地塞米松组小鼠渗出液量、白细胞数、PGE2和IL-1β水平显著下降(P<0.01或P<0.05),气囊组织中c PLA2和COX-2 m RNA和蛋白表达显著下调(P<0.01或P<0.05)。结论:1.TSD提取方法合理,含量测定方法简便、快速、准确、重复性好,可作为TSD和薯蓣皂苷的定量分析。提取物总皂苷及薯蓣皂苷含量能满足药效学实验的要求。2.TSD具有较强的抗炎镇痛作用,其抗炎作用机制可能与抑制c PLA2/COX信号通路减少相关炎性因子合成有关。
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