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肝脏作为机体重要的消化和解毒器官,之前的研究已经报道过量的氟暴露会引起肝脏细胞的自噬和凋亡,最终造成肝脏结构和功能的损伤。最近有研究报道IL-17在自噬和凋亡过程中发挥重要的作用。然而,IL-17在氟诱导肝损伤中的作用机制尚不清楚。因此,本论文建立了氟中毒小鼠模型,细胞模型,IL-17基因敲除小鼠模型,运用流式细胞术、组织染色、电镜、ELISA、qRT-PCR、western blotting、荧光染色、相关试剂盒检测各个模型中肝脏IL-17及其信号通路、凋亡、自噬情况,探索IL-17及其信号通路在氟致小鼠肝脏细胞自噬和凋亡中的作用机制。(1)氟中毒模型试验结果:试验通过0、25、50、100mg/LNaF处理150天,氟中毒模型的建立后发现氟暴露后PAS染色阳性区域减小,HE和TEM结果显示肝脏形态学和超微结构发生改变,ALT和AST含量在血清中增加,结果表明氟暴露诱导了肝脏结构和功能的损伤。进一步运用qRT-PCR、免疫组织化学和免疫印迹结果表明,氟暴露导致肝脏IL-17信号通路相关基因和蛋白表达含量改变,凋亡相关基因蛋白Caspase12、p53、Apaf-1、Caspase3和Cyt-c表达升高,以及肝脏线粒体自噬泡数量的增加和自噬相关基因蛋白Beclinl、LC3、p62表达的改变。这些结果提示NaF可能通过激活IL-17信号通路诱导肝脏细胞凋亡和自噬,最终导致肝功能受损。(2)C57氟中毒模型试验结果:在前期结果中发现氟暴露后肝脏超微结构中线粒体损伤严重,线粒体损伤又是线粒体自噬发生的诱因。因此推测线粒体自噬在氟诱导的肝脏损伤中发挥重要的作用。试验通过对C57小鼠攻0、25、50、100 mg/LNaF 12周建立氟中毒模型。检测相关指标后结果显示氟暴露后小鼠生长发育受到影响,12周后氟暴露组体重降低,骨氟含量升高,肝脏脏器比降低,肝脏和血清中ALT、AST含量升高。HE、PAS和TEM结果显示氟暴露后肝脏形态学和超微结构出现病理学损伤,肝细胞中线粒体数量减少,短直径增大。同时,氟暴露导致肝脏细胞线粒体膜电位升高,损伤增加。通过双重免疫荧光的共定位发现氟暴露后线粒体数量减少,碎片增多,溶酶体数量增多,且共定位的自噬体数量增多。总蛋白和线粒体蛋白中LC3含量也显著升高。这些结果提示氟暴露后肝脏细胞中线粒体自噬增强。进一步的结果显示氟暴露导致IL-17及其受体通路活化,肝脏细胞的凋亡数量增加,免疫组化的结果也显示凋亡相关蛋白Caspase3和Cyt-c表达升高。上述结果提示氟暴露导致肝脏中IL-17含量增加,从而激活IL-17受体通路,线粒体损伤增加导致细胞线粒体自噬增加,肝脏细胞凋亡增加,最终导致肝脏结构和功能的损伤。(3)体外模型试验结果:为进一步探索氟诱导的肝脏损伤中IL-17及其信号传导通路与线粒体自噬和凋亡之间的相互关系,试验运用AML-12小鼠肝脏细胞系建立IL-17干预的氟中毒模型。试验结果显示IL-17和NaF均导致AML-12细胞增值率降低。免疫荧光和总蛋白和线粒体蛋白检测后发现与NaF组对比,IL-17重组蛋白的添加导致线粒体自噬泡数量显著增加,总蛋白和线粒体蛋白中LC3的表达显著升高,且IL-17重组蛋白的添加进一步促进了 IL-17受体通路的活化。上述试验结果提示IL-17通过激活IL-17受体通路促进了氟诱导的肝脏细胞线粒体自噬。(4)IL-17基因敲除小鼠氟中毒模型试验结果:前期试验已经证实IL-17通过激活IL-17受体通路促进了氟诱导的肝脏线粒体自噬和凋亡。为进一步验证上述结果,试验运用IL-17基因敲除小鼠分别给野生型和敲除型小鼠攻50 mg/L的NaF建立氟中毒模型,试验结果显示IL-17基因的敲除缓减了氟诱导的形态学和超微结构的损伤。同时,通过流式细胞术、免疫荧光和总蛋白和线粒体蛋白检测后发现IL-17基因的敲除降低了IL-17受体通路相关蛋白的表达,并且缓减了氟暴露导致细胞自噬泡数量的增加和线粒体自噬相关蛋白LC3的表达以及肝脏细胞的凋亡率和凋亡相关蛋白,Caspase3和Cyt-c的表达水平。上述结果提示IL-17基因的敲除抑制了 IL-17受体通路受的活化,从而降低了线粒体损伤和线粒体自噬,进一步降低了肝脏细胞的凋亡,最终缓减了氟诱导的肝脏结构和功能的损伤。(5)肝脏炎症试验结果:IL-17作为重要的促炎因子,在多种炎症反应中发挥重要的作用。为进一步探索IL-17在氟诱导肝脏炎症损伤中的作机制,本章试验运用ELISA和流式细胞术检测肝脏中的炎症因子表达量和炎症细胞的含量水平。试验结果显示野生型小鼠氟暴露后,肝脏中的炎症因子(TNF-α、IL-17、INF-γ、IL-23、TGF-β)和炎症细胞(CD4+T细胞、巨噬细胞、肥大细胞、λδT细胞)含量均显著升高,表明氟暴露导致了肝脏炎症的发生。进一步通过荧光双标IL-17及炎症细胞运用流式细胞术检测后发现肥大细胞是氟暴露下肝脏中分泌IL-17的主要细胞。(6)肝脏mRNA和miRNA测序结果:通过对IL-17基因敲除小鼠氟中毒模型的mRNA和miRNA的测序,深入挖掘了氟对肝脏的损伤机制及其IL-17在氟致肝脏损伤的作用机制。结果显示氟暴露下肝脏中MAPK、AMPK、PPAR等细胞生物基础通路相关的mRNA和miRNA受到影响,进一步导致相关蛋白表达的紊乱,最终造成肝脏的损伤。IL-17在氟致肝脏的损伤中主要是通过影响细胞存活、细胞粘附、细胞连接等生物过程中相关mRNA和miRNA的表达,来发挥生物学作用。综上所述,IL-17在氟诱导肝脏损伤中的作用机制概括如下:氟暴露导致小鼠肝脏中IL-17含量的升高,从而激活IL-17受体通路,IL-17受体通路的活化能够诱导NF-kB通路,NF-kB通路的活化一方面诱导肝脏炎症,另一方面导致肝脏线粒体自噬增加,线粒体自噬的增加进一步增强肝脏细胞的凋亡。最终二者导致肝脏结构和功能的改变。IL-17 基因敲除小鼠氟中毒模型 mRNA 和 miRNA 的测序结果为进一步探索氟中毒机制和有效防治氟中毒提供一种新思路、新靶点和新的技术平台。