研究背景食管癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,约占所有恶性肿瘤的2%,在全球范围内,其发病率排名第八位,死亡率排名第六位[1-3]。食管癌的病理类型主要包括食管鳞状细胞癌(esophageal squamous carcinoma ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma EADC),同时食管癌还具有区域性分布的特点,大部分的食管鳞癌主要发生在亚洲国家。我国就是世界上食管癌发病率较高的国家之一,全世界每年因食管癌死亡的患者中,约有一半是中国人[4]。在我国的食管癌患者中约90%以上均为食管鳞状细胞癌。至于食管癌发生的部位,胸中段食管是食管癌最好发的部位,其次是胸下段食管,胸上段食管发生癌症的几率相对更少一些。随着社会科学的不断发展,目前食管癌的治疗已经发展成为以外科手术治疗为主,再辅助放、化疗等的综合治疗模式。在我国,外科手术仍然是可切除食管癌首选的治疗方法。近年来随着食管癌诊断技术的不断提高,手术操作技能的不断改进,术前新辅助化疗的应用,再加上术后规律放、化疗的施行,食管癌患者的生活质量在一定程度上逐步得到了改善,但是从整体上而言,食管癌治疗的效果仍然不尽如人意,我国食管癌患者术后的5年总体生存率仅为20%-30%[5-8]。在解剖学方面,食管的组织结构与其他消化管道存在有差异,在食管的粘膜固有层和粘膜肌层中存在有着丰富的淋巴管道[9],因此,即使在T分期较早的食管癌中也可以发生淋巴结的转移。有资料显示,在手术完全切除的食管癌患者中,仍有约27%的患者在手术后的2-3年之内出现淋巴结的转移性复发[10]。所以,我们除了通过健康查体尽可能做到早期诊断、早期治疗并进行积极预防之外,更深入地研究食管癌的发生、发展以及侵袭和转移的具体机制同时寻找更加有效的肿瘤标志物对于食管癌的诊断和治疗都具有非常重要的意义。食管癌的发生和发展是一个涉及多因素的多步骤的非常复杂的病理过程,近年来,随着人们对分子生物学认识的不断深入,大量的研究已经证明许多基因的特异性变化在肿瘤发生发展过程中发挥着重要的作用。尽管到目前为止食管癌发生和发展的确切机制尚不十分清楚,但是关于与食管癌相关的分子生物学标记物的研究一直以来都是食管癌研究领域的一个热门话题。而且由于食管癌患者的预后并不理想,因此,寻找能够准确预测食管癌患者预后的分子生物学指标也是目前迫切需要解决的问题,同时对于指导临床医师为食管癌患者术后选择针对性的辅助治疗也具有非常重要的意义。I型胶原蛋白(collagen type I)是胶原蛋白(collagen)的一种,是人体组织中分布最为广泛的胶原蛋白,它是细胞外基质的主要成分,是一种结构蛋白,其主要的功能是起到连接和支持组织细胞的作用,对于人体本身的作用是比较温和的。但是I型胶原蛋白的高表达与许多的纤维化疾病的发生是密切相关的,而目前的许多研究也发现I型胶原蛋白在多种肿瘤如前列腺癌[11]、乳腺癌[12]、胰腺癌[13]、脑肿瘤[14]等中也呈高表达。并且有资料显示,I型胶原蛋白在鳞癌中的表达要比在腺癌中的表达更具有活性[15]。因此,I型胶原蛋白可能在肿瘤发生和发展的过程中扮演一个非常重要的角色。转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1i,TGF-β1)是TGF超家族中的一个成员,它与肿瘤之间关系的研究一直以来都是人们研究的焦点。研究发现,TGF-β1也在多种肿瘤中呈现高表达,如结肠癌[16]、膀胱癌[17]、卵巢癌[18]、肾癌[19]、淋巴瘤[20]等,而且其可能在肿瘤的浸润和转移过程中发挥着重要作用。有资料显示,TGF-β1对于肿瘤的作用机制不仅仅具有复杂性,而且还具有矛盾性,在肿瘤发生的早期它可以抑制细胞的增殖、启动细胞的分化、诱导细胞凋亡；但是当细胞发生恶变时,TGF-β1又可以起到促进肿瘤细胞侵袭和转移的作用[21,22]。同时也有研究证实,TGF-β1还具有强有力的刺激I型胶原蛋白合成的作用[23]。到目前为止,有关I型胶原蛋白是否在食管鳞癌细胞中呈高表达,其与食管鳞癌各临床病理特征以及预后的关系如何,在食管鳞癌中I型胶原蛋白和TGF-β1的表达之间是否也具有相关性,国内外几乎没有相关的报道。而关于TGF-β1与食管鳞癌之间关系虽然已经有一些研究,但是研究的结果却不尽相同,有的结果甚至完全相反,究竟哪些结果更准确,我们目前尚无法判断,但是如果我们要进行更深一步的研究,而由于前人的研究并不能给予我们确切的结果进行指导,所以,我们就必须以自己的实验结果作为研究的基础,这也是我们再次选择TGF-β1作为研究对象的原因之一。本课题通过应用免疫组织化学、western免疫印迹、实时定量-聚合酶联反应的实验方法分别从蛋白和基因的不同角度研究了Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1在食管鳞癌组织中的表达以及二者的相关性,并探讨了Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1与食管鳞癌各临床病理特征及预后之间的关系。旨在为探索食管癌的发生、发展机制,寻找特异的预后指标以及为食管癌的治疗寻找理想靶点提供有力的理论依据,同时我们也希望能够为人类在战胜恶性肿瘤的道路上贡献自己的一点微薄之力。第一部分：Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1在食管鳞癌中的表达及与生物学特性的关系目的：食管癌的发生和发展是一个由多因素参与的多步骤的复杂的病理过程,本文旨在研究Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1在食管鳞癌组织中的表达以及与食管鳞癌各临床病理特征之间的关系,以探讨其在食管鳞癌的发生、发展过程中可能的作用。方法：本实验收集了2010年3月-2011年1月期间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除的82例食管鳞癌患者的标本,其中包括82例食管鳞癌组织及随机选取的20例癌旁正常食管粘膜组织。采用免疫组化和Western-blot的方法检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管粘膜组织中Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1的表达情况,采用实时荧光定量PCR方法检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管粘膜组织中Ⅰ型胶原蛋白和TGF-β1mRNA的表达情况。应用SPSS16.0统计软件对实验结果进行统计学分析,将患者的临床资料、病理学特征及实验结果共同建立数据库,计数资料采用x2检验或Fisher’s精确概率检验；计量资料用均数土标准差表示,两组均数比较时采用独立样本t检验(方差齐时)或t’检验(方差不齐时)；多组计量资料均数之间的比较采用方差分析(F检验),如果差别有统计学意义,则行SNK检验法进行组间两两比较,Ⅰ型胶原蛋白与TGF-β1表达水平的相关性采用Sperman或Person法进行相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。结果：免疫组化结果显示：I型胶原蛋白的阳性表达表现为在细胞浆内出现棕黄色的颗粒,食管鳞癌组织中I型胶原蛋白表达明显高于癌旁正常食管粘膜组织(P=0.000),I型胶原蛋白的表达与肿瘤的浸润深度(pT)、淋巴结转移和pTNM分期相关(P=0.030,P=0.044,P=0.034),随着肿瘤浸润深度的增加和pTNM分期的增高,I型胶原蛋白的表达呈增高趋势,有淋巴结转移的食管鳞癌组织的I型胶原蛋白的表达要明显高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织；TGF-β1蛋白的阳性表达表现为在细胞浆内或者细胞膜上出现棕黄色的颗粒,食管鳞癌组织TGF-β1蛋白表达也明显高于癌旁正常食管粘膜组织(P=0.008),TGF-β1蛋白的表达与肿瘤的浸润深度(pT)、淋巴结转移和pTNM分期相关(P=0.014,P=0.033,P=0.017),随着肿瘤浸润深度的增加和pTNM分期的增高,TGF-β1蛋白的表达明显增高,有淋巴结转移的食管鳞癌组织的TGF-β1蛋白的表达要明显高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织；并且I型胶原蛋白与TGF-β1在食管鳞癌中的表达水平呈显著相关(r=0.743,P=0.000)。Western-blot结果显示食管鳞癌组织中I型胶原蛋白表达水平显著高于癌旁正常食管粘膜组织(P=0.000),I型胶原蛋白表达水平与肿瘤浸润深度(PT)和pTNM分期相关(P=0.000,P=0.000),随着肿瘤浸润深度的增加和pTNM分期的增高,I型胶原蛋白表达水平逐渐增高,经过SNK检验进行组间比较,不同肿瘤浸润深度(pT)各组之间均有显著差异(P<0.05),TNM分期各组之间进行比较,pI期组与pII期组和pIII期组间存在显著差异(P<0.05),而pII期组和pIII期组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；TGF-β1蛋白在食管鳞癌组织中表达水平要显著高于癌旁正常食管粘膜组织(P=0.000),TGF-β1蛋白表达水平与肿瘤浸润深度(pT)、淋巴结转移和pTNM分期相关(P=0.000,P=0.043,P=0.000),随着肿瘤浸润深度的增加和pTNM分期的增高,TGF-β1蛋白表达水平逐渐增高,有淋巴结转移的食管鳞癌组织的TGF-β1蛋白表达水平要明显高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织,经过SNK检验进行组间比较,不同肿瘤浸润深度(pT)各组之间均有显著差异(P<0.05),而TNM分期各组之间进行比较,pI期组与pII期组和pIII期组间存在显著差异(P<0.05),pII期组和pⅠII期组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；并且经Person法检验I型胶原蛋白与TGF-β1蛋白在食管鳞癌组织中的表达水平呈显著正相关(r=0.765,P=0.000)。实时荧光定量PCR结果显示：食管鳞癌组织中I型胶原蛋白mRNA相对表达量要明显高于癌旁正常食管组织(P=0.000),有淋巴结转移的食管鳞癌组织的I型胶原蛋白mRNA的相对表达量要显著高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织(P=0.030,P=0.001)；随着肿瘤浸润深度的加深、TNM分期的增高I型胶原蛋白mRNA的表达呈显著增高(P=0.000,P=0.000),经过SNK检验进行组间比较,不同肿瘤浸润深度(pT)各组之间均有显著差异(P<0.05),TNM分期各组之间进行比较,P I期组与pII期组和pIII期组间存在显著差异(P<0.05),而p II期组和PHI期组之间的差异无统计学意义(P>0.05)；食管鳞癌组织中TGF-β1mRNA相对表达量要明显高于癌旁正常食管组织(P=0.000,P=0.000),有淋巴结转移的食管鳞癌组织的TGF-β1mRNA的相对表达量要显著高于无淋巴结转移的食管鳞癌组织(P=0.001)；随着肿瘤浸润深度的加深、TNM分期的增高TGF-β1mRNA的表达呈显著增高(P=0.000,P=0.000),经过SNK检验进行组间比较,结果显示各组之间的差异有统计学意义(P<0.05)；而且I型胶原蛋白mRNA和TGF-β1mRNA在食管鳞癌中的表达水平呈显著正相关(r=0.636,P=0.000)。结论：食管鳞癌组织中存在着I型胶原蛋白和TGF-β1的高表达,而且两者的表达呈正相关。食管鳞癌组织中的I型胶原蛋和TGF-β1的表达均与肿瘤的浸润深度(pT)、淋巴结转移和pTNM分期显著相关,提示I型胶原蛋白和TGF-β1可能在食管鳞癌的发生、发展和浸润、转移过程中发挥着重要作用。第二部分： I型胶原蛋白和TGF-β1与食管鳞癌预后关系的研究目的：食管鳞癌具有发病率高、死亡率高和预后差的特点,本实验主要探讨I型胶原蛋白和TGF-β1与食管鳞癌预后关系,旨在寻找能够更准确预测食管癌预后的生物学指标。方法：本实验收集了2010年3月-2011年1月期间在山东大学附属省立医院胸外科施行食管癌完全切除的82例食管鳞癌患者的标本。采用免疫组化方法检测食管鳞癌组织中I型胶原蛋白和TGF-β1的表达情况,应用SPSS16.0统计软件对实验结果进行统计学分析,将患者的临床、病理学特征及IHC实验结果共同建立数据库,采用Kaplan-Meier法计算生存率,Log-rank检验比较生存率的差异,应用Cox回归分析判定影响食管鳞癌术后生存率的独立危险因素。P<0.05表示有统计学意义。结果：所有患者术后均进行随访,平均随访时间为22.5个月(8-36个月),本组82例食管鳞癌患者术后总体3年生存率是53.7%。Kaplan-Meier单因素分析结果显示：肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、pTNM分期、I型胶原蛋白和TGF-β1都是影响食管鳞癌患者术后3年生存率的相关因素。不同肿瘤的浸润深度(pT)的食管鳞癌患者的3年生存率分别为pTl组：100%,pT2组：53.3%,pT3组：39.3%,各组间的差异具有统计学意义(P<0.05)；淋巴结转移阴性和阳性的食管鳞癌患者的3年生存率分别为：67.3%和25.9%,两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)；不同pTNM分期的食管鳞癌患者的3年生存率分别为pI组：100%,pII组：52.5%,pIII组：28.6%,各组间差异具有统计学意义(P<0.05)；TGF-β1蛋白表达阳性和阴性的食管鳞癌患者的生存率分别为41.7%和86.4%,两组间的差异具有统计学意义(P<0.05)；I型胶原蛋白表达阳性和阴性的食管鳞癌患者的生存率分别为45.3%和83.3%,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。Cox回归分析显示：只有肿瘤浸润深度(pT)(P=0.047)和淋巴结转移(P=0.007)是影响食管鳞癌患者术后3年生存率的独立危险因素。结论：肿瘤的浸润深度(pT)、淋巴结转移、pTNM分期、I型胶原蛋白和TGF-β1与食管鳞癌患者预后相关。但是只有肿瘤浸润深度(pT)和淋巴结转移是食管鳞癌患者预后的独立危险因素。第三部分：TGF-β1对Eca109细胞合成I型胶原蛋白影响的研究目的：TGF-β1和I型胶原蛋白在食管鳞癌细胞中的表达具有相关性,本文旨在探讨通过TGF-β1作用于体外培养的食管癌Eca109细胞,是否会能够影响I型胶原蛋白的合成,并进一步探讨TGF-β1影响食管鳞癌细胞合成I型胶原蛋白的作用机制。方法：体外培养食管癌Eca109细胞,用5ng/ml的TGF-β1分别作用于培养细胞0h,12h、24h、48h后收集细胞,用不同浓度Ong/ml、1ng/ml、5ng/ml和lOng/ml的TGF-β1作用Eca109细胞48h,采用qRT-PCR和Western-blot方法检测TGF-β1作用后的Eca109细胞中I型胶原蛋白的表达情况,结果进行半定量。用设计好的Smad4siRNA序列,应用1ipofectamine2000进行转染,沉默Eca109细胞系的Smad4基因,再用TGF-β1作用Eca109细胞,采用Western-blot方法检测Eca109细胞中I型胶原蛋白的表达情况,SPSS16.0统计软件进行统计学分析,以P<0.05为具有统计学意义。结果：qRT-PCR结果显示：TGF-β1作用Oh、12h、24h、48h的Eca109细胞I型胶原蛋白mRNA相对表达量之间存在显著差异(P<0.05)。组间两两比较显示,TGF-β1作用12h、24h和48h的Eca109细胞I型胶原蛋白mRNA的表达量要明显高于作用Oh(P<0.05),作用24h和48h的I型胶原蛋白mRNA的表达量明显高于作用12h(P<0.05),而作用24h和48h两组的I型胶原蛋白mRNA的表达量无明显差异(P>0.05)。不同浓度的TGF-β1作用Eca109细胞48h的I型胶原蛋白mRNA相对表达量之间存在显著差异(P<0.05),随着TGF-β1浓度的升高I型胶原蛋白mRNA的表达量也逐渐增加。Western-blot结果显示,TGF-β1分别作用Oh、12h、24h、48h的Eca109细胞I型胶原蛋白相对表达量之间也存在显著差异(F<0.05)。组间两两比较,TGF-β1作用12h、24h和48h的Eca109细胞I型胶原蛋白的表达量要明显高于作用Oh(P<0.05),作用24h和48h的I型胶原蛋白的表达量明显高于作用12h(P<0.05),而作用24h和48h两组的I型胶原蛋白的表达量无明显差异(P>0.05)。不同浓度的TGF-β1作用Eca109细胞的I型胶原蛋白的相对表达量之间存在显著差异(P<0.05),随着TGF-β1浓度的升高I型胶原蛋白的表达量也同步增加。沉默Smad4基因后Eca109细胞I型胶原蛋白的表达明显减少,而沉默Smad4基因后再加入TGF-β1处理因素,TGF-β1上调Eca109细胞I型胶原蛋白表达的作用则消失。结论：TGF-β1能通过下游的Smad信号转导通路促进食管鳞癌细胞合成和分泌I型胶原蛋白,在食管鳞癌的浸润和转移过程中可能发挥重要作用。