微生物降解是去除环境雌激素污染的主要手段之一。已有多株雌激素降解菌被分离,但其降解基因与调控机制仍未解析,限制了其环境修复的应用。细菌对天然雌激素物质雌二醇（Estrodial,E2）的降解可将其转化为雌酮（Estrone,E1）后再进行后续转化。因此,雌二醇向雌酮转化的氧化还原反应被认为是整条代谢途径的限速步骤,催化该步骤的酶为雌二醇降解的关键酶;其转录表达水平变化会直接影响菌株的雌激素效能。但目前催化该步骤的酶及其编码基因尚未被鉴定,酶学功能尚不明确,转录调控机制仍不清楚。本课题以雌激素降解恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）SJTE-1为研究对象,通过基因克隆与体外表达纯化及酶学性质测定,对其潜在的雌激素降解关键基因进行了筛选与功能鉴定,确定了催化雌二醇降解的第一步关键酶及其性质。在此基础上,对可能参与该酶表达调控的转录因子进行了体外克隆与表达纯化;并通过体外结合实验与足迹试验,确定了转录因子与目标基因上游区域的结合比例、解离效应物及特异结合区域等性质。通过序列同源性分析,我们从恶臭假单胞菌SJTE-1基因组中筛选了可能参与雌激素降解与调控的22个功能基因和6个转录因子基因;利用体外克隆表达和亲和纯化,成功获得了16个编码降解酶的重组蛋白与4个转录因子蛋白。体外酶学性质检测显示,由SJTE-1₀062/1052/3864/4227/1172/1008/3029基因编码的7个重组蛋白可氧化E2;其中,由基因SJTE-1₀062（命名为3,17β-hsd）编码的3,17β-羟基类固醇脱氢酶（3,17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase,3,17β-HSD）的催化活性最高。该酶以NAD⁺为辅因子,其Km为0.0802 mM,Vmax为0.9706 mM/s;二价金属离子可影响其活性且存在浓度依赖效应,Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺可提高其活性,而Cu²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺则对其活性有抑制作用;其最适催化温度为42度,但对温度很敏感,42度处理30分钟使其几乎丧失全部活性。偏碱性环境有利于该酶活性,pH 9.0为其最适pH,其活性可保持6小时。该酶除了可以E2为底物,还可催化睾丸酮（Testosterone,TES）和菲的侧链羟基向酮基的转化,而对E1等无催化活性。HPLC检测显示E1为该酶氧化E2的主要产物,5分钟内其底物转化效率高达96.5%,说明该酶可高效催化类固醇激素D环侧链17位碳的氧化反应,在雌二醇降解中起重要作用。在此基础上,我们对可能参与该3,17β-HSD酶调控的转录因子进行了鉴定。将体外表达纯化的4个转录因子重组蛋白与3,17β-hsd（SJTE-1₀062）基因上游区域进行了体外结合,通过凝胶阻滞和足迹试验检测了其结合性质。凝胶阻滞实验结果显示,由SJTE-1₀063基因编码的AraC家族转录因子和由SJTE-1₁173编码的LysR家族转录因子可与3,17β-hsd基因的上游区域发生明显的特异性结合,且结合会随转录因子蛋白的浓度增加而增强。类固醇激素可有效解离这一结合作用,同等浓度条件下睾丸酮的解离能力最强;而E2对蛋白/DNA结合低摩尔比下的解离效果较好,E1则可有效解离高摩尔比条件下的蛋白对DNA的结合作用。DNase I足迹实验进一步证实AraC和LysR均在3,17β-hsd基因上游有两个结合区域,一个靠近3,17β-hsd的起始密码子,一个则位于其上游约100 bp处。这些结果均显示转录因子AraC和LysR可能参与了3,17β-HSD酶的转录调控。本课题的研究将有助于推进恶臭假单胞菌SJTE-1中雌激素降解与调控分子机制的研究,并为其工程改造与高效应用提供理论指导。