LncRNA03882对卵巢癌细胞的迁移和侵袭影响及机制研究

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目的:对基因芯片分析筛选出来的在卵巢癌中具有差异表达的长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,Lnc RNAs)进行生物信息学分析和功能研究,探讨其对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及分子机制。方法:(1)生物信息学在线工具CRC(Coding Potential Caculator:http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)分析Lnc RNA03882的不编码能力。(2)生物信息学在线工具Annolnc(http://annolnc.cbi.pku.edu.cn/)分析Lnc RNA03882在肿瘤组织和正常组织中的表达情况。(3)利用Person相关性分析筛选出可能与Lnc RNA03882表达水平相关的基因,并用皮尔逊相关系数来表示共表达的强度。(4)选取皮尔逊相关系数较高的基因,利用生物信息学进行基因本体学分析(gene ontology,GO分析)及相关信号通路分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)。(5)通过q RT-PCR检测Lnc RNA03882在卵巢癌细胞中的表达水平。(6)利用特定si RNA敲低Lnc RNA03882在SKOV3细胞中的表达。(7)利用Transwell迁移和侵袭实验检测Lnc RNA03882对SKOV3细胞迁移和侵袭的影响。(8)通过Lnc Locater数据库分析出Lnc RNA03882的定位。(9)荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)验证Lnc RNA03882的定位。(10)利用q RT-PCR,Western Blot检测敲低Lnc RNA03882后,相关基因锌指E盒结合蛋白1(Zinc Finger E-Box Binding Homeobox 1,ZEB1)的表达。(11)利用RIP技术研究Lnc RNA03882与ZEB1之间的相互作用。(12)利用Western Blot技术研究敲低Lnc RNA03882后,SKOV3细胞中E钙黏蛋白(E-Ca2+dependent cell adhesion molecules family,E-cadherin)的表达水平。(13)基于TCGA的数据库,利用Kaplan-Meier生存分析法研究Lnc RNA03882对卵巢癌的预后作用。结果:(1)生物信息学分析CRC中预测Lnc RNA03882编码能力的评分值是-1.12117为负值;Lnc RNA03882的Phylo CSF值小于0的,说明其没有编码保守型。(2)卵巢癌组织样本中Lnc RNA03882的每千基百万个片段(Fragments Per Kilobase Million,FPKM)表达量较正常组织高。(3)与Lnc RNA03882相关的基因中Pearson相关系数(Pearson Correlation Coefficient)≥0.8的共表达基因有207个。(4)对207个相关基因和Lnc RNA03882进行GO分析,主要富集在细胞周期调控过程,细胞迁移、侵袭过程等;KEGG通路分析主要富集在细胞周期,有丝分裂等。(5)q RT-PCR检测发现Lnc RNA03882在卵巢癌细胞系中高表达,在卵巢正常组织中低表达。(6)特异性si RNA使得Lnc RNA03882在SKOV3细胞中低表达。(7)Lnc RNA03882敲低后,SKOV3的迁移和侵袭能力减弱。(8)FISH实验表明Lnc RNA03882在胞质和胞核中均表达,但胞质中表达水平高于胞核。(9)敲低Lnc RNA03882后,ZEB1的m RNA水平和蛋白水平均下调。(10)RIP实验证实Lnc RNA03882可以与ZEB1直接结合。(11)ZEB1作为负向调控转录因子抑制E-cadherin的转录,敲低Lnc RNA03882后,ZEB1蛋白水平下调,E-cadherin表达水平上调。(12)高表达Lnc RNA03882病人的生存率明显低于高表达Lnc RNA03882病人的生存率。结论:基于生物信息学、细胞和分子生物学研究发现Lnc RNA03882在卵巢癌中具有差异表达意义,参与卵巢癌的多种生物学过程,其中与卵巢癌的迁移、侵袭、预后有关,未来有望成为卵巢癌的新型诊断分子。
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