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目的:肺癌是发病率、死亡率上升最快的恶性肿瘤之一,目前多种治疗效果不理想。化合物GA是从一系列赤霉素衍生物中筛选得到、具有抗肿瘤活性的新四环二萜类化合物,前期研究发现对肺癌细胞有生长抑制作用,本课题将在前期研究的基础上,重点针对人非小细胞肺腺癌,以人非小细胞肺腺癌细胞株A549、SPCA1和宣威肺癌细胞株XWLC-05为体外实验模型、以A549和XWLC-05裸小鼠异种移植瘤为体内实验模型,重点评价化合物GA的体内外抗肿瘤作用和体内荷瘤动物重要器官毒性评估,探讨GA潜在的临床应用价值及可能的应用模式,为推动其临床转化奠定基础。方法:第一部分:1.以人非小细胞肺腺癌细胞株A549、SPCA1和宣威肺癌细胞株XWLC-05为体外实验模型,应用MTT法检测化合物GA对肺癌细胞增殖的抑制作用;2.以小鼠移植性肉瘤S180、人非小细胞肺腺癌A549和XWLC-05裸小鼠异种移植瘤为体内实验模型,以抑瘤率、肿瘤相对生长率(T/C)为指标,评估化合物GA灌胃给药体内对肿瘤生长的抑制作用,并同步评估GA对荷瘤小鼠体重、重要免疫器管-胸腺、脾脏的影响。第二部分:裸小鼠体内抑瘤实验结束后,留取骨髓、肠道及肾脏组织检测化合物GA的毒性。骨髓涂片采用瑞氏-姬姆萨染色法观察荷瘤裸小鼠骨髓增殖情况;肠道、肾脏组织制成病理切片,采用HE染色、镜下观察形态学变化,研究化合物GA的相关毒性。第三部分:1.以人非小细胞肺腺癌细胞株A549、SPCA1和XWLC-05为实验模型,采用TUNEL染色、流式细胞术(FCM)检测肺癌细胞经过GA作用后的凋亡情况及形态学变化。Western Blot技术检测化合物GA作用肺癌细胞后,凋亡线粒体途径相关标志性蛋白表达的变化、细胞色素C释放及线粒体膜电位的变化。同样通过Western Blot技术检测死亡受体途径、内质网途径诱导凋亡的标志性蛋白变化。2.体内A549裸小鼠移植瘤实验结束后,通过电镜观察化合物GA作用后,A549移植瘤组织细胞形态、细胞质及细胞核的变化。应用免疫组织化学法,观察肿瘤组织Caspase3、Caspase8、Caspase9表达的变化,并采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡发生。第四部分:1.以人非小细胞肺腺癌细胞株A549、SPCA1和宣威肺癌细胞株XWLC-05为体外实验模型,MTT法初步评估化合物GA联合低浓度DDP对肺癌细胞是否具有增效/等效作用。以小鼠移植性肉瘤S180及人非小细胞肺腺癌A549和XWLC-05裸小鼠移植瘤为体内实验模型,以抑瘤率、肿瘤相对生长率(T/C)及联合指数为指标,评估化合物GA与低剂量DDP联用的体内抑瘤作用,同时通过骨髓、肠道、肾脏的相关病理学检测,初步评估对DDP毒性的影响。结果:1.化合物GA的体内外抑瘤作用及毒性评估1.1化合物GA抑制A549、SPCA1和XWLC-05细胞增殖,其中对A549和SPC-A-1的抑制作用较强,对XWLC-05细胞的抑制作用较弱。高浓度GA的作用强度与阳性对照DDP相近。1.2化合物GA对小鼠移植性肉瘤S180的生长有抑制作用,中、高剂量抑瘤作用较为明显。GA对人肺腺癌A549和XWLC-05裸小鼠移植瘤的生长有抑制作用,以中、高剂量作用明显。1.3化合物GA对荷S180小鼠重要免疫器官-胸腺/脾脏、荷人肺癌裸小鼠脾脏、荷瘤动物体重未观察到明显影响,对荷瘤裸小鼠骨髓、肠道、肾脏组织无明显损伤。而DDP导致小鼠和裸小鼠明显的体重下降、免疫器官重量减轻,肾脏组织损伤明显。2.化合物GA与化疗药顺铂(DDP)联用的体内外抑瘤作用及毒性评估2.1化合物GA联合低浓度DDP对多种肺腺癌细胞增殖有明显抑制作用,DDP较低浓度与GA联用,可达到较高浓度DDP单用的抑制强度,二者在一定浓度范围内呈现协同作用。2.2体内实验结果显示,化合物GA联合低剂量DDP对小鼠S180、A549及XWLC-05裸鼠移植瘤的生长有抑制作用,两药联合在体内表现为相加或协同作用。2.3化合物GA联合低剂量DDP对荷瘤小鼠及裸小鼠的脾脏指数、胸腺指数、体重无额外影响,对骨髓、肠道、肾脏也未增加毒性。3.化合物GA体内外诱导肿瘤细胞凋亡及相关机制3.1化合物GA体外诱导多种肺腺癌细胞凋亡,同时检测到细胞中caspase9被剪切激活、线粒体胞色素C释放、Bax/Bc12出现变化;caspase4被剪切激活,GRP78、GADD153和ATF4的mRNA及蛋白水平显著升高;caspase8未被剪切激活。3.2体内实验结果提示,化合物GA促进肿瘤组织细胞凋亡、其Caspase3、8、9均呈明显的阳性表达。结论:1.化合物GA体内外实验均证实可抑制多个肺腺癌的增殖;2.化合物GA体内对骨髓、肠道、肾脏组织均无明显影响,呈现低毒的特点。3.化合物GA促进肺腺癌细胞凋亡,其机制涉及线粒体和内质网途径,可能未涉及死亡受体途径。GA体内诱导肺癌组织细胞凋亡。4.化合物GA与低剂量DDP联合应用,可提高抗肿瘤效果,未增加毒性,有可能以联合肺腺癌一线化疗药的方式在临床发挥增效减毒作用,为DDP毒性明显的患者提供更多选择。