论文部分内容阅读
工业生产多采用兽疫链球菌(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)发酵生产透明质酸(Hyaluronic acid,HA),HA是以荚膜的形式存在的。回应调节物CovR和CovS是双组份单一转录调控体系的一员,CovR可结合到HA荚膜操纵子(has)的启动子上,从而影响HA的合成。covR/S基因在A群链球菌以及其他一些菌中被广泛研究,但在兽疫链球菌中缺乏相关方面的报道。本研究以兽疫链球菌ATCC39920为研究对象,研究covR/S基因的功能及其对HA合成的影响,研究结果如下:(1)研究covR/S基因在兽疫链球菌基因组中的位置及其蛋白功能在NCBI数据库中检索covR/S基因,找到其在兽疫链球菌基因组中的位置,并检索其蛋白序列。发现covR与covS在位置上是相邻的,检索氨基酸序列发现NCBI中CovR蛋白的功能是TCS回应调节物,CovS蛋白的功能是TCS传感激酶。(2)基因可对兽疫链球菌菌株生长产生积极影响构建△covR,△covS,△covRΔ covS 及 covR/Op,covS/Op 菌株,固体平板划线发现敲除菌株生长速率低于野生型,过表达菌株高于野生型。进一步摇瓶发酵数据表明野生型菌株的生长速率明显高于Δ covR菌株,△ covS菌株高于Δ covR菌株且低于Δ covRΔ covS菌株,covR/Op菌株高于野生型菌株而低于covS/Op菌株。由此得出结论:covR/S基因对兽疫链球菌的生长产生积极的影响。(3)covR/S基因对HA合成的影响采用发酵方式分析七株菌株,发现covR基因的敲除导致HA产量的降低,covS基因的敲除对HA产量的影响比较复杂,前期HA产量明显低于野生型,后期超越野生型。过表达菌株HA产量明显高于野生型,且covS/Op高于covR/Op菌株,表明covR/S基因对HA合成产生积极影响。乳酸产量及蔗糖消耗分析表明物质消耗与产物积累保持一致。(4)covR/S基因对HA的分子量产生积极影响采用琼脂糖胶电泳实验形象展示七株菌的分子量大小并采用粘度计估算HA分子量数值。琼脂糖凝胶电泳图表明敲除菌的分子量依次降低;过表达菌株依次升高;此结果与粘度计测量方法估算值保持一致。上述结果表明covR/S基因对HA分子量产生积极影响。(5)温度、钙离子以及镁离子对covR/S基因的影响采用摇瓶发酵方式分析各种环境因素对covR/S基因的影响。发现covS基因可对兽疫链球菌的温度耐受性产生消极影响;covR/S基因对镁离子无响应;covS基因存在致使兽疫链球菌对钙离子耐受性变低。