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C/EBPβmRNA的3’非翻译区(3UTR)具有逆转细胞恶性表型的功能,即具有肿瘤抑制作用。前已发现,C/EBPβmRNA的3UTR能与细胞骨架组分之一的中间丝蛋白质——细胞角蛋白18(CK18)专一地结合。这提示,上述3UTR可能通过结合中间丝蛋白以某种方式对细胞的生长和增殖进行调控。在体外对CK18与C/EBPβmRNA3UTR的结合进行了分析。在大肠杆菌中表达并纯化了CK18:紫外光交联将其和C/EBPβ3UTR mRNA共价结合;将结合物通过蛋白酶完全酶解CK18:用SE柱纯化结合有RNA的肽段;用RNases去除未与肽结合的RNA,最后用SE柱纯化与RNA结合的短肽段。这就是寻找的RNA的结合位点。用质谱分析鉴定了这些短肽段,并将鉴定出的肽段人工合成后体外与C/EBPβ mRNA3UTR进行结合检测。结果发现CK18上与C/EBPβmRNA3UTR的结合位点为Ala-Gln-Tyr-Asn-Asp-Leu-Ala-Arg(AQYDELAR),位于CK18分子接近中间的部分。
在以上结果的基础上,对C/EBPβ3UTRRNA在人肝癌细胞系SMMC-7721中的肿瘤抑制作用的分子机制进行了探索。流式细胞仪的分析发现,高表达C/EBPβ3UTR的回复突变细胞株Cl1细胞部分被阻抑在S期,从而细胞增殖被抑制;激光共焦显微镜检查发现CK18排列发生了改变;Western blot发现CK18的表达及磷酸化程度均有降低,说明使CK18磷酸化的某种蛋白激酶的活力有降低。由于细胞内原位杂交实验发现C/EBPβ3UTR RNA和CK18共定位,显然,这些变化与CK18、细胞内大量存在的3UTR RNA和相关的蛋白激酶的相互作用密切相关。化学小分子蛋白激酶抑制剂库筛选证实,使CK18磷酸化的酶是蛋白激酶Cε(PKCε);进一步的激酶活性实验说明,CEBPβ3UTR RNA可以直接抑制PKCε的活性,而免疫共沉淀结合Western blot的结果提示,C/EBPβ3UTR RNA、PKCε和CK18三者形成一个复合物。结论:C/EBPβ3UTR RNA在SMMC-7721细胞中是通过与PKCε、CK18直接相互作用,抑制PKC3的活性,来发挥其肿瘤抑制作用的。这就是C/EBPβ3UTR的肿瘤抑制功能的分子机制所在。此现象说明,某些真核mRNA的3UTR可以作为反式调控因子,调控非本身mRNA的表达以至细胞的生长增殖。