花色素苷类化合物,作为植物来源的可溶性色素成分,不但可作为安全无毒的天然色素加以开发,还具有抗氧化、抗肿瘤,以及降低血糖和血脂等多种重要的药理功能,因此具有很大的研究和应用价值。通过对模式植物的研究,植物花色素苷的合成途径已基本明确。紫心甘薯作为花色素苷的优质原料作物,因其富含花色素苷的部位为深埋地下的块根而具有一定的特殊性。其花色素苷的合成和积累方式与其他植物是否存在差异值得研究。查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)作为花色素苷合成代谢中的主要酶类之一,其在紫心甘薯花色素苷合成代谢中的作用有待研究。针对紫心甘薯在理论研究中试材的独特性及其在开发应用上的巨大潜力,本文以紫心甘薯CHI作为研究对象,从紫心甘薯中chi基因的结构、不同着色特征的甘薯品种(系)中chi基因表达的差异及其影响因素、CHI蛋白的亚细胞定位,以及chi基因对环境因子胁迫的响应等几个方面开展了研究,获得的主要研究结果如下：1.本文以紫心甘薯品种“山川紫”为材料,从其块根中克隆获得chi基因的全长cDNA序列,将其命名为Ibchi。对其进行生物信息学分析表明,Ibchi cDNA全长844 bp,其包含一段长度为732 bp的ORF序列,编码243个氨基酸。预测的IbCHI蛋白分子量为25.5 kDa,等电点为5.09；其二级结构由41.98%的a-螺旋、32.1%的无规卷曲、18.52%的延伸链,以及7.41%的β-转角所组成,a-螺旋是其主要结构基元。IbCHI蛋白三级结构的预测结果表明,CHI蛋白保守活性中心氨基酸残基(T50、Y108、N115和S192)均分布于三级结构的中央蛋白催化腔内。通过氨基酸多重比对和进化树分析表明,IbCHI与其它植物的CHI序列具有较高的同源性和共同的进化起源。2.在不同甘薯品种(系)“山川紫”、“A5”和“禺北白”中,Ibchi基因的编码区内均无内含子插入,均以多拷贝的形式存在,并且表现出明显的限制性片段长度多态性(RFLP)。说明不同品种(系)的甘薯中,Ibchi基因的旁侧序列存在着遗传变异。3.构建了Ibchi基因原核表达载体pQE30+Ibchi,并探索出可溶性IbCHI重组蛋白的最佳表达条件为18℃、0.2mM IPTG、180 rpm诱导10 h,通过His-tag亲和层析分离纯化获得了可溶性的IbCHI重组蛋白,并制备获得其多克隆抗体。4.构建了用于IbCHI蛋白亚细胞定位分析的Ibchi基因真核超表达载体pBEGFP+Ibchi。在农杆菌LBA4404的介导下,将Ibchi-EGFP基因导入洋葱表皮细胞中,在荧光显微镜下观察IbCHI-EGFP融合蛋白的亚细胞定位。结果表明,IbCHI蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中均有分布。5.构建了Ibchi基因真核超表达载体pCambial 300-221-myc+Ibchi,并通过农杆菌花序浸泡法,成功地将Ibchi基因导入到拟南芥chi缺失突变体tt5中。通过Hyg抗性筛选获得了转Ibchi基因的拟南芥纯合体株系。表型观察发现,转基因植株种子表皮的颜色从突变体的浅黄色恢复到野生型的深棕褐色。由此验证了本文克隆获得的Ibchi基因是有功能的序列,其在花色素苷合成中能够发挥作用。6.不同着色特征的甘薯品种(系)“山川紫”、“A5”和“禺北白”的Ibchi基因内共有15个碱基位点发生变异；白心品种“禺北白’’Ibchi基因的核苷酸序列与紫心品种(系)(“山川紫”、“A5”)相比,有5个碱基发生了突变。7.不同着色特征的甘薯品种(系)“山川紫”、“A5”和“禺北白”的IbCHI蛋白中共有7个氨基酸位点存在差异；白心品种“禺北白”与紫心品种(系)“山川紫”、“A5”相比,有4个位点的氨基酸种类、极性和酸碱性发生了改变。8.在不同品种(系)甘薯的叶、茎、块根皮和块根肉中,Ibchi基因均有表达,但其表达模式呈现出较大的差异,其表达量因组织的不同而变化：在花色素苷含量较高的组织中Ibchi基因表达量也较高,包括：“A5”和“山川紫”块根的皮和肉、“A6”的块根肉,以及“山川紫”和“紫茎甘薯”的茎和幼叶；而在不含花色素苷的组织中Ibchi基因表达量很低,包括：“禺北白”和“紫茎甘薯”的白色块根肉,“A5”和“A6”的绿色幼叶。各组织中,Ibchi基因的表达量与花色素苷的含量呈相同的变化趋势。同时,本文通过比较5个品种(系)块根中花色素苷含量和Ibchi基因表达量的差异,也发现二者呈现出相同的变化规律。此外,本文研究还发现不同花色素苷含量的块根中,IbCHI蛋白的表达水平也与花色素苷含量的变化趋势相符合。上述结果说明,甘薯中Ibchi基因的表达与其花色素苷的合成积累是同步的,Ibchi基因是甘薯花色素苷合成代谢中的关建酶基因。9.不同浓度蔗糖的诱导培养试验结果表明,蔗糖可诱导野生型和转Ibchi基因的拟南芥植株中花色素苷的合成,而chi缺失突变体tt5无响应。此外,与Ler野生型植株相比,转Ibchi基因的拟南芥植株对蔗糖的诱导更为敏感。当培养基中蔗糖浓度为30 g/L时,所有转基因植株的子叶和上胚轴均变为紫色,而只有部分野生型植株的子叶颜色变紫。而当培养基中蔗糖浓度上升到45 g/L时,全部野生型植株的子叶和上胚轴变为紫色。10.高光胁迫的试验结果表明,在高光处理下,突变体tt5叶片中荧光参数Fv/Fm和Yield值下降较快,而转Ibchi基因的拟南芥植株和Ler野生型植株相当,其Fv/Fm和Yield值下降较缓慢。说明Ibchi基因的导入可提高突变体植株对高光胁迫的耐受能力。11.干旱胁迫试验结果表明,干旱处理8d后,土壤中含水量接近于零,此时突变体tt5植株的茎干发生倒伏,叶片枯萎明显,而转Ibchi基因的拟南芥植株和Ler野生型植株茎干直立,叶片枯萎程度较轻。测定其叶片中的荧光参数Fv/Fm和Yield值发现,在干早胁迫过程中,突变体植株的荧光参数值下降较快,而转基因植株和野生型植株相当,其荧光参数值下降较缓慢。复水3d后,转基因植株和野生型植株叶片的的Fv/Fm和Yield值均可以恢复到接近处理前的水平,而突变体植株无法恢复。说明,Ibchi基因的导入可提高突变体植株对干旱胁迫的耐受能力。