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目的:通过在体外建立人肺泡上皮细胞(A549)与人肺脏成纤维细胞(IMR-90)共培养模型的基础上,探究肺泡上皮细胞Wnt/β-catenin信号对肺脏成纤维细胞间质化特性产生影响的分子机制,为临床治疗特发性肺纤维化(IPF)提供新靶点奠定理论基础。方法:1.在体外建立人肺泡上皮细胞A549的气液相培养模型。试验中采用组织化学染色法(HE)、扫描电镜、透射电镜等方法对气液相培养的人肺泡上皮细胞A549的表面形态和内部超微结构进行观察;同时,利用免疫荧光染色法、免疫印迹和RT-PCR分别对培养3天,1周,2周,3周的A549细胞气液相培养模型中肺泡I型上皮细胞表面标志物AQP-5、肺泡II型上皮细胞表面标志SP-C、以及肺泡上皮细胞中特有的上皮表面标记物TTF-1、ZO-1、MUC5B等分子的表达情况进行分析鉴定。2:将上述建立的人肺泡上皮细胞A549细胞气液相培养模型,与人肺脏成纤维细胞(IMR-90)共培养,通过Wnt3a蛋白和XAV939试剂来改变上皮细胞中的Wnt/β-catenin信号强度,同时用BLM处理共培养模型来探究Wnt/β-catenin信号和BLM在肺纤维化发生中的关系。利用Western Blot的方法检测了共培养模型中肺脏成纤维细胞的表面标志物vimentin,肌成纤维细胞表面标志物α-SMA的蛋白表达情况,最后运用ELISA的方法检测共培养上清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量。结果:1.气液相培养的A549细胞在微孔膜上形成了一层完整的细胞层。电镜下细胞形态很不规则,表面有凸起,细胞间隙有大量的分泌物存在;单个细胞和细胞器的轮廓不清,细胞生长紧密,互相堆集在一起,透射电镜下可以看出细胞与细胞之间有明显的细胞连接。同时我们发现,气液相培养的A549细胞,在细胞胞膜和细胞胞浆内分别表达了ACEI细胞表面标志物AQP-5蛋白,TTF-1蛋白和ACEII细胞表面标志物SP-C蛋白,而且这些蛋白的表达显示出一个动态的变化过程,有趣的是,除了在气液相培养三天的细胞中未检测到上皮细胞紧密连接蛋白(ZO-1)外,在其他时间段的气液相培养的细胞和非气液相培养的细胞中均检测到了ZO-1的表达;另外,转录水平的结果显示,与非气液相条件下的培养相比,气液相条件下的A549细胞SP-C,AQP-5,TTF-1和ZO-1的mRNA表达增高,且P<0.05,有统计学意义,尤其是培养到第二周时表达量最高。2.在肺泡上皮细胞与肺脏成纤维细胞共培养的条件下,激活上皮细胞中的Wnt/β-catenin信号和用BLM刺激时,与对照组相比,使得成纤维细胞表面标志物vimentin蛋白表达量降低,且P<0.05;而肌成纤维细胞表面标志物α-SMA蛋白的表达却明显地增加,且P<0.05,这些蛋白表达量的变化有统计学意义,TGF-βRI蛋白的表达也相应地升高;而且共培养上清中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量与对照相比也显著地升高,P<0.05,有统计学意义。有趣的是,同时接受XAV939和BLM刺激的实验组中,这些蛋白的表达与细胞因子的分泌量都比BLM单独刺激时低。结论:1.A549细胞在气液相培养条件下生长状态良好,在气液相膜上形成了一层完整的细胞层。2.气液相培养的A549细胞能够部分地分化为肺泡I和II型上皮样细胞,具有体内肺泡上皮样结构,可以作为模拟体内肺泡结构的一个体外模型,用于体外研究肺泡上皮细胞的作用和在肺脏疾病中的致病机理。3.在肺泡上皮细胞与肺脏成纤维细胞的共培养模型中,改变上皮细胞的Wnt/β-catenin信号,能够影响共培养体系中上皮细胞炎症因子的分泌,进而改变了共培养体系中肺脏成纤维细胞的间质化特性,使得成纤维细胞表现出纤维化的特点。4.在体外肺泡上皮细胞和肺脏成纤维细胞共培养体系中,Wnt/β-catenin信号抑制剂XAV939通过抑制肺泡上皮细胞中的Wnt/β-catenin信号减轻了由BLM诱导的共培养体系中两种细胞的纤维化特性的表现。