[研究背景]原发性肝癌是指源于上皮组织的发生在肝脏的恶性肿瘤,其中肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma HCC)占90%以上,恶性程度最高。据估计,全球每年HCC的新发病例和死亡人数的一半发生在中国。因此,研究肝癌具有十分重要的意义。研究显示环氧合酶2(Cyclooxygenase-2 COX-2)在肿瘤发生发展过程中起到了重要的作用。所以,对于HCC患者针对COX-2的靶向治疗可能是一种很有前景的方法。然而,肝癌细胞对已有的化疗药物耐药。研究证实,自噬是促使肿瘤细胞对化疗药物耐药性的原因之一。因此,抑制自噬可能增加肿瘤细胞对于化疗药物的敏感性。HBV是发展为HCC的最重要的致病因素。乙肝病毒X蛋白(Hepatitis B virus x protein)是HBV病毒中多功能调节蛋白,在HCC的发生、发展过程中起重要的作用。HBx可以通过激活COX-2/PGE2途径阻止p53诱导的细胞凋亡,而COX-2抑制剂能够阻止这种效应,并且促使细胞凋亡。而且,自噬与乙肝病毒(Hepatitis B virus)复制有重要的联系。因此,抑制COX-2联合抑制自噬可以作为HBV相关肝癌患者的治疗方法。[目的]抑制COX-2联合抑制自噬增加肝癌细胞的凋亡,特别是用于HBV相关肝癌的治疗。通过抑制自噬下调HBx增强的自噬水平,联合抑制COX-2,进而上调内质网应激(Endoplasmic reticulum stress ERS)的程度,最终诱导肝癌细胞凋亡。[方法]一.用 MTT(Methylthiazolyltetrazolium 四甲基偶氮唑蓝)和 Annexin-V+PI 双染的方法观察COX-2抑制剂塞来昔布对于肝癌细胞HepG2和HepG2 2.15增殖及凋亡的影响。二.用倒置相差显微镜、MDC(Monodansylcadaverine单丹磺酰戊二胺)染色、透射电镜观察顺铂诱导肝癌细胞发生自噬的形态变化。通过MTT、Annexin-V+PI双染观察顺铂单独使用、顺铂联合COX-2抑制剂塞来昔布、顺铂联合自噬抑制剂3-MA(3-methyladenine 3-甲基腺嘌呤)、COX-2抑制剂联合自噬抑制剂分别作用后,对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。从mRNA水平和蛋白水平比较自噬相关基因Beclinl、LC3、凋亡相关基因Bax、ERS相关基因GRP78和CHOP与COX-2的表达。三.用免疫组化染色的方法,检测81例HCC患者组织标本中HBx、COX-2、Beclin1的表达,分析它们与患者临床病理特征之间的关系。四.构建真核表达载体pEGFP-N1-HBx,转染于肝癌细胞HepG2,诱导外源性HBx蛋白过表达。HBx/HepG2与HepG2细胞通过MTT、Annexin-V+PI双染观察HBx蛋白对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。从mRNA水平和蛋白水平比较自噬通路、ERS相关基因、COX-2与凋亡相关基因Bax的表达变化。[结果]1.塞来昔布对于肝癌细胞的抑制率和凋亡率呈时间剂量依赖。2.不同浓度顺铂作用肝癌细胞后,倒置相差显微镜下可见细胞皱缩、数目减少。通过MDC染色、透射电镜进一步证实顺铂诱导肝癌细胞发生自噬。顺铂单独使用、顺铂联合COX-2抑制剂塞来昔布、顺铂联合自噬抑制剂3-MA、COX-2抑制剂联合自噬抑制剂分别作用后,通过MTT、Annexin-V+PI双染观察发现它们均可以增加肝癌细胞抑制率和凋亡率,然而自噬抑制剂显著增加肝癌细胞的凋亡。COX-2抑制剂塞来昔布可以上调ERS相关基因GRP78和CHOP的表达,ERS系统凋亡执行蛋白CHOP可以上调凋亡基因Bax的表达,诱导肝癌细胞凋亡。3.免疫组化染色显示,HBx、COX-2、Beclin1三个基因在HCC患者的肿瘤组织中共表达。在HBx表达阳性的患者中,Beclin1的表达与病理分级相关,而在HBx表达阴性的患者中,则不一定。Beclin1与肿瘤的大小相关(P<0.05),HBx、COX-2、Beclin1和年龄、性别、肿瘤数目、肝硬化病史、AFP、血管侵犯、HBsAg、临床分期等因素无关(P>0.05)。成功构建真核表达载体pEGFP-N1-HBx,转染于肝癌细胞HepG2。HBx可以增强顺铂诱导的自噬,MTT、Annexin-V+PI双染观察发现HBx蛋白调节肝癌细胞的存活是自噬依赖性的。从mRNA水平和蛋白水平证实抑制COX-2和抑制自噬,最终通过ERS凋亡执行蛋白CHOP上调促使肝癌细胞凋亡。[结论]1.靶向抑制COX-2对肝癌细胞有明显的抑制增殖和促凋亡作用。2.抑制COX-2和自噬可以作为HBV相关肝癌的治疗方法。3.临床病理证实HBx和COX-2、Beclin1蛋白表达相关。4.HBx在诱导肝癌自噬的过程中,是促进肝癌细胞存活的因素。自噬抑制剂下调HBx增强的自噬水平,联合抑制COX-2,能够上调ERS的应激水平,引起自噬通路与ERS通路的“串扰”,最终诱导肝癌细胞发生凋亡。