研究背景与目的肩袖损伤(rotator cuff tear)是目前临床上肩关节功能障碍患者最常见的病因,通常会引起肩关节长期疼痛和活动受限。尽管肩袖修复手术技术不断进步,但肩袖损伤的治疗依然是一个难题,手术重建后肩袖再发撕裂率可高达20%~94%。正常的肌腱末端插入骨的部位是由高度特化的界面组织构成,其依次由肌腱、纤维软骨、钙化软骨、骨这四层组织组成,以利于将肌肉产生的牵引力从肌腱稳稳地传递到骨,实现骨骼运动。然而,病理学研究表明手术重建后肩袖止点组织结构无法恢复到正常形态,最主要的难题是愈合后的腱骨界面内纤维软骨层无法再生,仅由瘢痕组织替代,导致形成的间接止点机械性能远低于正常的直接止点,容易发生再撕裂。因此,纤维软骨区是腱骨连接部位特征性结构,它能够缓冲应力,减少再撕裂发生,此软骨再生对改善肩袖腱骨愈合质量起重要作用。近年来,国内外研究者们利用多种生物学技术来促进肩袖修复后腱骨界面软骨再生,试图恢复正常腱骨连接部的组织形态,以改善腱骨愈合部的机械性能。从目前的研究现状来看,该研究领域主要有机械应力刺激、细胞生长因子、生物酶、间充质干细胞、生物材料增强技术这五方面的进展。尽管大多数研究结果显示了良好的软骨再生效果和改善的抗拉强度,但离恢复到正常水平仍相距甚远,且技术干预方法较为复杂,成本较高,仍无法进行临床应用。因此,促进肩袖腱骨愈合更为有效和便捷的生物干预方法仍待进一步探索。Kartogenin(KGN)是最近3年新发现的一种人工合成的小分子化合物,能够诱导内源性间充质干细胞(MSCs)成软骨分化,起初在骨关节炎软骨修复研究中被发现。这个药物的独特之处在于,药物作用过程中无需添加外源性种子细胞和支架,与传统组织工程软骨再生原理不同。同时,有研究发现KGN还具有促进肌腱发育和增殖的作用。因此,KGN对软骨和肌腱再生均具有积极作用,这个优点为将KGN应用于改善腱骨愈合的研究设想提供了重要依据。此外,肩袖损伤后邻近滑膜和肌腱等组织来源的MSCs被发现参与促进腱骨愈合,因此,这些自体MSCs极有可能在KGN诱导下发生成软骨分化并合成软骨基质,促进腱骨愈合界面软骨再生,最终改善腱骨愈合质量。为了证实这个假设,我们进行了本课题的实验研究,旨在探明KGN是否能够促进肩袖腱骨愈合界面软骨再生,使腱骨界面正常形态重演,从而改善腱骨愈合机械强度,以探索新的促进肩袖腱骨愈合的生物干预手段。研究内容与方法采集2014年07月至2015年06月期间于第二军医大学附属长征医院关节外科行膝关节镜术患者的健康滑膜标本,以及接受髋关节置换术患者的新鲜骨髓标本,分别通过原代培养及鉴定获得滑膜来源间充质干细胞(SMSCs)和骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)。利用CCK-8细胞计数法检测不同浓度KGN对SMSCs和BMSCs增殖能力的影响,利用q RT-PCR检测不同浓度KGN对SMSCs和BMSCs软骨表型基因表达的干预作用,并比较KGN干预下两种细胞成软骨分化能力的差异。以纤维蛋白胶为药物载体制备KGN-蛋白胶载药复合体,体外条件下利用荧光光谱技术监测KGN在制备过程中的损失情况以及复合体中KGN的缓释情况,确定此载体的可行性。建立肩袖损伤修复兔模型,均行右侧肩关节手术,应用KGN-蛋白胶复合体干预腱骨愈合,利用组织学染色和腱骨愈合成熟度评分评价肩袖修复术后6周时不同浓度KGN对腱骨愈合界面软骨再生的影响,寻找KGN促进腱骨愈合的最佳药物浓度,此阶段15只新西兰大白兔随机分成5组(无植入物组、纤维蛋白胶组、100μmol/L浓度KGN组、500μmol/L浓度KGN组和1mmol/L浓度KGN组),每组3只。第二阶段利用最佳浓度KGN改善肩袖腱骨愈合质量,通过增加样本量来验证KGN的药物作用,36只兔随机分成3组(无植入物组、纤维蛋白胶组和最佳浓度KGN组)3个时间点(术后3周、6周和12周),每组12只,用于组织学分析;54只兔随机分成3组(无植入物组、纤维蛋白胶组和最佳浓度KGN组)3个时间点(术后3周、6周和12周),每组18只,用于生物力学分析。为了探索KGN促进腱骨愈合的具体机制,根据以往文献报道,我们选择了8个与软骨和肌腱再生相关的候选靶基因(CBFβ、RUNX1、RUNX2、TGFβ、BMP-7、BMP-2、Smad5、Smad4)进行q RT-PCR筛选,检测KGN对SMSCs细胞内这些候选基因的表达影响。利用si RNA基因干扰技术使细胞内BMP-7基因(筛选获得的目的基因)表达下调,通过q RT-PCR和Western blot检测KGN对BMP-7下调后SMSCs成软骨分化信号通路下游相关基因表达影响;通过免疫荧光染色验证被KGN激活后的细胞信号通路中BMP-7和Smad5基因之间的上下游调控关系。利用慢病毒介导的基因过表达技术使细胞内BMP-7基因表达上调,通过q RT-PCR和Western blot检测KGN对BMP-7上调后SMSCs成软骨分化信号通路下游相关基因表达影响。同时,我们对1mmol/L KGN干预6周和12周后的肩袖腱骨愈合部界面组织进行了免疫组化染色分析,在动物体内水平证实KGN通过上调BMP-7/Smad5通路来诱导自体间充质干细胞成软骨分化,促使腱骨愈合界面软骨再生,改善肩袖腱骨愈合质量。研究结果与结论在本课题研究中,我们得到了以下结果:1、原代培养的人SMSCs和BMSCs经鉴定均具有多向分化潜能,发现KGN对细胞生长毒性小,在不同检测时间点,KGN在10nmol/L~10μmol/L时均能促进SMSCs细胞增殖,其中10μmol/L时促增殖作用最强;KGN仅在10μmol/L能促进BMSCs细胞增殖,且此作用仅表现在加药后第2至4天内。2、q RT-PCR检测发现1μmol/L和10μmol/L KGN能促进SMSCs糖胺聚糖和II型胶原基因表达显著升高,100μmol/L KGN能促进SMSCs基质金属蛋白酶组织抑制剂-1基因表达明显升高;BMSCs仅100μmol/L KGN干预下糖胺聚糖和II型胶原基因表达升高,但差异无统计学意义。证明多种间充质干细胞能被KGN诱导向软骨细胞分化并合成软骨基质成分,且SMSCs对KGN诱导作用的应答反应比BMSCs更强烈,也说明SMSCs成软骨分化能力优于BMSCs。3、成功制备了以纤维蛋白胶为载体的KGN药物缓释系统,荧光光谱技术检测证明在KGN-纤维蛋白胶复合体制备过程中,KGN损失量可忽略不计,随时间延长,KGN能从复合体内缓慢释放出来,作用于周围微环境。4、成功建立肩袖损伤修复兔模型,组织学染色和腱骨愈合成熟度评分发现不同浓度KGN均能在不同程度上促进腱骨愈合界面软骨再生,在1mmol/L浓度时KGN促进腱骨愈合效果最佳。在手术后3周、6周和12周时,1mmol/L KGN组腱骨愈合界面软骨细胞再生量、腱骨愈合成熟度总体评分、腱骨愈合部抗拉强度和刚度均明显优于无植入物组和纤维蛋白胶组,差异有统计学意义。5、q RT-PCR筛选获得KGN诱导自体MSCs成软骨分化并促进腱骨愈合相关的靶基因BMP-7和Smad5,基因干预技术、免疫荧光染色、q RT-PCR和Western blot证实KGN通过激活BMP-7/Smad5通路诱导自体MSCs成软骨分化并合成软骨基质。6、免疫组化染色分析发现KGN组肩袖腱骨愈合界面组织内BMP-7和Smad5蛋白表达明显升高,故在动物体内水平进一步证实了BMP-7/Smad5细胞信号通路在KGN诱导自体MSCs成软骨分化并进一步促进腱骨界面软骨再生和改善腱骨愈合过程中起着关键调控作用。通过上述研究结果,我们发现小分子化合物KGN能够通过激活BMP-7/Smad5通路,诱导内源性MSCs向软骨细胞分化并合成软骨基质,促进腱骨愈合界面软骨再生,使腱骨连接部正常形态重演,同时又能够改善腱骨愈合部的机械性能,最终在一定程度上改善了肩袖腱骨愈合质量。本研究发现了一种新的促进肩袖腱骨愈合的生物干预方法,本研究结果有助于将来进一步了解KGN在腱骨愈合领域的独特应用价值,为更深入的应用研究和相关机制研究提供重要依据。