本文以马氏珠母贝全基因组测序和外套膜转录组数据库为基础,从外套膜的边缘膜(MO)区和中央膜(MC)区分别筛选出差异高表达的特异性功能基因,利用RACE技术克隆其序列全长,同时对候选基因进行氨基酸序列分析和结构特征性分析来确定是否具有矿化相关功能。然后通过荧光定量分析基因表达的组织差异,RNAi诱导基因沉默以探索其在贝壳矿化中的作用。结果如下:1.筛选MC特异性表达基因:MC的主要功能是形成贝壳珍珠层。从马氏珠母贝外套膜转录组文库中,筛选出MC显著高表达的基因共有2298个,MC特异性表达的基因共228个,获得NR注释的基因197个。其中包括酪氨酸酶、钙结合蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂TIMP、硫脂蛋白、MRNP等,还包括一些预测蛋白,如prestin-like、酪氨酸蛋白激酶、溶质载体家族等。本研究对其中MC特异性表达的基因进行序列特征性分析,同时由注释信息得到并分析基因的功能结构域,最终选出4个基因进行深入研究,它们是几丁质结合蛋白、类-α-2巨球蛋白、MRNP(methionine-rich nacre protein)和未注释基因5915。2.采用RACE技术获得几丁质结合蛋白基因的cDNA序列,其全长为2126 bp,5’UTR为143 bp,3’UTR为492 bp,开放阅读框为1491 bp,编码496个氨基酸。由注释信息及SMART预测出其具有Chitin-bind-3结构域,说明其能够结合几丁质。荧光定量PCR结果显示在马氏珠母贝的珍珠囊、外套膜的套膜区(MP)和MC中显著高表达(p<0.05)。RNAi结果显示,注射几丁质结合蛋白-dsRNA能够显著地抑制外套膜中几丁质结合蛋白mRNA的表达;同时导致贝壳内表面的珍珠层结晶形态不完整,片层状板块细碎,晶体排列间隙大,局部有洞穴存在的现象,而正常的珍珠层晶体则是规则排列,各板块晶体排列紧密且界限清晰,因此推断几丁质和几丁质结合蛋白是贝壳珍珠层有机质不可或缺的组分。3.类-α-2巨球蛋白(α2M-like)基因cDNA序列全长为3127 bp,5’UTR为390 bp,3’UTR为322 bp,开放阅读框为2415 bp,编码804个氨基酸。SMART预测其C端含有典型的α-2巨球蛋白较保守的三个结构区,即内部硫酯区、受体结合区和诱饵区,以及98-GCGEQNM-304硫酯键结构,故名。但是与典型的α-2巨球蛋白相比,α2M-like N端部分缺失,该现象也出现在太平洋牡蛎贝壳蛋白中,表明α2M-like基因可能在双壳类动物中具有不同的功能并可能与矿化作用相关。荧光定量结果显示α2M-like基因在外套膜中显著高表达于其他组织(p<0.05)。在RANi实验中,与对照组相比,注射α2M-like-dsRNA能够显著地抑制外套膜MC和MO的α2M-like mRNA表达水平,而在MP的表达量并没有明显下降。扫描电镜结果显示:α2M-like基因沉默,导致贝壳珍珠层和棱柱层超微结构发生变化,结晶体均形状不规则,排列疏松,甚至有溶解消失的情况出现。因此,可初步确认α2M-like参与了贝壳棱柱层和珍珠层的生物矿化过程。4.克隆获得马氏珠母贝的MRNP(methionine-rich nacre protein,Pm-MRNP)基因cDNA序列全长为1226 bp,5’UTR为99 bp,3’UTR为446 bp,开放阅读框为681 bp,编码226个氨基酸。对Pm-MRNP氨基酸序列进行特征性分析结果显示,MRNP属于碱性不溶性基质蛋白,含8个保守的Cys残基,形成4对潜在的二硫键,其序列富含MG-repeats结构域。氨基酸多重序列比对结果发现,Pm-MRNP与珠母贝和大珠母贝一致性高达85%,说明MRNP在珍珠贝属里序列高度保守。荧光定量结果表明,Pm-MRNP在马氏珠母贝的珍珠囊、外套膜的MP和MC中显著高表达(p<0.05)。RANi实验结果显示,注射Pm-MRNP-dsRNA后,实验组外套膜的Pm-MRNP mRNA比对照组的相对表达量显著下降(p<0.05);通过SEM扫描电镜观察贝壳内表面的超微结构,显示实验组贝壳珍珠层表现出结晶形态不完整、不规则,板块晶体颗粒较小。因而证实Pm-MRNP在马氏珠母贝中参与了贝壳珍珠层的形成。5.未注释功能基因82.8 kDa蛋白基因cDNA全长为3083 bp,5’UTR为199 bp,3’UTR为592 bp,开放阅读框为2292 bp,编码763个氨基酸。NetOGlyc和kinasephos软件预测其分别有65个糖基化位点和26个磷酸化位点,可能经过复杂的糖基化、磷酸化翻译后修饰。此外,ProtParam预测为碱性不溶性分泌蛋白;IUPred网站预测为特有Repeated low complexity domains(RLCDs)结构的固有非序蛋白(IUPs or IDPs)。二级结构则主要由α-螺旋、β-折叠和无规卷曲组成。荧光定量结果显示其在马氏珠母贝的珍珠囊、外套膜的MP和MC中显著高表达(p<0.05)。RANi实验结果表明,注射82.8 kDa蛋白-dsRNA导致外套膜中mRNA的相对表达量显著下降(p<0.05);通过SEM检测,发现实验组贝壳珍珠层表现出结晶形态不完整,片层状板块细碎且局部存在间隙,因此推断82.8 kDa蛋白参与了贝壳珍珠层的形成。