鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis, DVH)是雏鸭的一种高度致死性急性传染病,以肝炎为其主要特征,病原是鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus, DHV)。我国流行的鸭肝炎以1型DHV (DHV1)为主。疫苗接种是预防本病最有效的措施,我国目前尚无商品化疫苗。本研究以1型DHV A66弱毒株第60代次(E60)鸡胚毒为始发毒,经鸡胚克隆化选育获得DHV A66株,在对A66株的安全性、免疫原性、纯净性和遗传稳定性检测的基础上,进一步开展鸭病毒性肝炎活疫苗(A66株)的安全性和效力试验、生产工艺等研究及中试生产工作,并在农业部行政审批许可后进行了疫苗临床试验,最终完成了鸭病毒性肝炎活疫苗(A66株)研制。1、DHV A66弱毒株的克隆筛选以1型DHV A66弱毒株第60代次(E60)鸡胚毒为始发毒,采用有限稀释法接种SPF鸡胚进行3次克隆化筛选、2次纯培养和1次扩大培养获得66代次(E66)种毒,通过毒价、毒力、免疫原性、特异性、纯净性等测定,表明克隆纯化的E66代种毒符合疫苗研制毒种要求,可作为鸭病毒性肝炎活疫苗研发的原始毒种,并命名为DHV A66株。2、DHV A66株种毒的安全性、免疫原性、遗传稳定性和纯净性研究以DHV A66株E66代次种毒,分别经皮下注射和口服途径大剂量接种1日龄敏感雏鸭各10只,接种雏鸭临床观察正常,剖检观察肝脏等内脏组织无肉眼可见病理变化,肝脏等组织切片检查无异常。再以该种毒经皮下注射途径大剂量接种1日龄敏感雏鸭20只,于接种后不同时间采集血液进行细胞计数、血沉测定、血红蛋白测定等血常规检查,同时取血样分离血清进行反映肝脏机能状态的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、谷氨酰胺转移酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)等血清酶和胆红素测定。结果显示：试验鸭的血常规及四种血清酶和总胆红素(TBIL)测定值与健康对照鸭均无明显差异,但强毒对照鸭于接毒后24-36h的测定值与健康鸭有显著(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)。毒株遗传稳定性方面,以DHV A66株E66代次的种毒,每次用1～3日龄敏感雏鸭10只,连续传代回归10次进行毒力返强试验。结果各回归代次雏鸭肝组织能稳定分离到DHV,且组织含毒量相对稳定在103.5-4.8ELD50/ml范围；各代次回归试验鸭健康,剖检观察正常,病理组织学检查正常；各代次试验鸭的血液常规指标、四种主要血清酶和总胆红素(TBIL)值均正常。对DHV的A66-F10与F0全基因组序列比对和分析表明,全基因组核苷酸序列没有发生插入或缺失,两者仅有6个核苷酸差异,同源性达99.9%以上,ORF氨基酸序列未发生改变。充分证明DHV A66株具有良好的安全性和遗传稳定性。以DHV A66株种毒经9～10日龄SPF鸡胚连续传代至E80代,通过对不同代次种毒的病毒含量及对1日龄雏鸭的毒力和免疫力的测定,结果表明：不同代次种毒毒价在108.10-8.50ELD50/ml之间,皮下注射免疫的半数免疫量(IMD50在106.10-6.40IMD50/ml范围,表明A66株免疫原性稳定而良好。因此,确定E66为原始种子代次,基础种子代次为E67～72,种子继代培养不超过3代,即生产用抗原最高代次为E75。通过对A66株E66、E70和E75代次鸡胚混合毒的最小免疫量测定,并取A66株鸡胚传代较高代次E75以不同倍数最小免疫量进行免疫试验,确定A66株的最小免疫量为103.3ELD50；根据免疫试验结果及其它因素综合考虑,确定A66株的免疫剂量(即使用剂量)应≥104.3ELD50。按照现行《中华人民共和国兽药典》[16]规定方法,对DHV A66株种毒E66、E70代毒种进行无菌检验和外源病毒检验,结果细菌和支原体检验阴性,12种现行《中华人民共和国兽药典》[16]规定检测的外源病毒和鸡传染性贫血病毒(CIAV)也全部为阴性,表明DHV A66株毒种纯净。3、检验用鸭肝炎强毒株(W株)的系统鉴定通过对DHV W强毒株接种雏鸭复壮,进行病毒传代、毒力及其稳定性测定、血清学特异性及与DHV R85952强毒参考株进行毒力比较试验等,认定DHV W毒株可作为检验用强毒。对W毒株的攻毒剂量和保存期试验表明：W株的攻毒剂量1～7日龄选用103.0LD50/鸭,7～10日龄选用104.0LD50/鸭；W株的肝组织毒冻干后在-20℃和-70℃中保存期分别可达5年和8年。4、鸭病毒性肝炎活疫苗(A66株)的安全性、效力和保存期研究对5批实验室制备的DHV(A66株)活疫苗,分别通过皮下注射、口服途径对1日龄敏感雏鸭进行一次单剂量接种、单剂量重复接种和一次大剂量接种的安全性试验。临床观察试验雏鸭的精神、采食、饮水、生长、增重等均正常,肝功能检查、解剖观察肝脏等内脏组织器官及肝脏组织切片检查无异常。试验结果表明：A66活疫苗对雏鸭使用安全性好、无副作用。用A66株最高代次(E75代)生产用毒种制备的三批疫苗,每批疫苗分别经皮下注射、肌肉注射、饮水和口服途径免疫易感雏鸭各10只。试验结果表明：经皮下和肌肉注射途径免疫雏鸭,2-3天就能产生免疫保护力；经口服、滴鼻和饮水途径免疫雏鸭,5天能产生良好的保护效果。以该三批疫苗1/10使用剂量免疫1日龄易感雏鸭5天后(120h)用强毒株进行攻毒,免疫组雏鸭全部保护,表明用A66株最高代次毒种制备的疫苗仍具有良好的免疫效力。将疫苗按免疫剂量接种1日龄易感雏鸭,雏鸭的免疫期至少达60天以上,即一次免疫就能有效保护雏鸭安全度过易感期(6周龄以内雏鸭)。采用10倍免疫剂量的DHV(A66株)活疫苗,分别经皮下注射和口服途径接种1日龄易感雏鸭各20只,5日后随机取出其中10只与20只1日龄易感雏鸭进行第1代同居饲养5日,再取10只同居感染鸭与20只1日龄易感雏鸭进行第2代同居感染试验,如此连续进行5代次的同居感染试验。通过定时采集接种鸭及同居鸭肛拭子样品进行PCR检测,测定DHV A66株的感染和排毒情况；对接种或同居5日的试验鸭进行攻毒保护试验,测定同居感染的保护情况。结果表明：A66株活疫苗经皮下注射和口服途径接种雏鸭,均可以通过粪便向体外排泄病毒；同居易感雏鸭可经粪—口途径接触感染,感染雏鸭可获得鸭肝炎的免疫保护；同居感染现象随着同居代次的增加,同居感染的排毒时间逐渐延迟、感染率逐步下降,至同居5代时这种同居感染现象基本终止。选择经鸭肝炎疫苗免疫的种鸭所产种蛋孵化的雏鸭,采用鸡胚中和试验测定其鸭肝炎母源抗体水平；对不同母源抗体水平的雏鸭于1日龄时用1羽份疫苗进行免疫,分别于免疫后2天和5天用1型DHV W株强毒攻击,结果表明,母源抗体水平对鸭肝炎活疫苗免疫效果无明显影响。以制备的3批A66株活疫苗分别经过不同保存温度、不同保存期后,测定其鸡胚半数致死量(ELD50)的变化情况,判定疫苗的稳定性；通过对疫苗的免疫攻毒保护试验、物理性状观察、水分及真空度测定,以确定疫苗的保存期。试验结果表明DHV (A66株)活疫苗在-15℃条件下可保存2年以上,2-8℃条件下可保存1年以上；疫苗用生理盐水稀释后在室温(25)℃条件下存放8h毒价下降不明显。5、鸭病毒性肝炎活疫苗(A66株)的生产工艺研究和中试生产选择蔗糖、明胶、蛋白(氨基酸)等组份,与真空度、升温速度等因素,通过水平正交设计试验进行冻干保护剂筛选和冻干曲线的优化研究。根据试验结果确定A66株活疫苗生产工艺为：种毒以100～1000倍稀释、经尿囊腔途径接种9～11日龄SPF鸡胚,0.2ml/胚,收获接种后36～72h死亡鸡胚组织(胚体+胚膜+胚液),用组织捣碎机匀浆3～5分钟后保存；优化的保护剂配方和冻干条件为：5%蔗糖、1.5%明胶、6%甘氨酸的保护剂,真空度0.02mbar,升温速度为1.5℃/min。抗原与保护剂1：1比例,在冻干曲线：-40℃3h;-25℃13h;-10℃4h;25℃4h时,疫苗冻干效果最佳。按照确定的保护剂和冻干条件验证3批产品,其物理性状、真空度、残余水分含量均符合《中华人民共和国兽药典》[16]规定,3批疫苗冻干前后毒价损失≤100.6滴度。按照本研究制定的《鸭病毒性肝炎活疫苗中间试制规程及质量标准》(草案),在南京天邦生物科技有限公司进行中试生产了5批鸭肝炎活疫苗(A66株),共计605万羽份。5批疫苗按照中间试制规程和质量标准进行检验,结果物理性状、无菌检验、支原体检验、病毒含量、安全检验、效力检验、剩余水分测定、真空度测定均符合标准。表明该疫苗生产工艺合理,产品质量稳定,适合规模化生产。6、鸭病毒性肝炎活疫苗(A66株)临床试验2008年12月27日获得农业部兽用生物制品临床试验批件(批件号：200844)后,自2009年2月至6月在安徽省5个鸭场(企业)应用5个批次的中间试制产品进行临床试验,试验共计免疫雏鸭5.9万羽。经临床观察、攻毒试验、抗体检测及生产性能的统计分析,结果表明：鸭病毒性肝炎活疫苗(A66株)对免疫雏鸭安全、有效、无不良反应。