目的:本文在苎麻根抗胃癌有效物质组分最佳提取纯化工艺研究的基础上,对苎麻根抗体外抗胃癌的作用进行研究,采用HPLC-Q-TOF-MS对苎麻根抗胃癌药效物质组分进行表征以明确其物质体系的组成,通过流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell小室实验阐明苎麻根体外抗胃癌的初步作用机制。对苎麻根有效组分是否对免疫细胞具有调节作用,为其今后是否通过免疫调节进一步对抗肿瘤方面产生影响提供一定的基础。进一步从相关基因的角度对苎麻根抗胃癌有效物质组分的药效机制进行初步研究,并从中药多靶点及多通路的作用特点进行阐述,为苎麻根药材在今后抗胃癌新药方面的进一步开发应用提供理论依据。材料与方法:1.以苎麻根抗胃癌有效组分的提取溶剂用量、提取所需时间、提取的次数等因素为考察对象,以紫外分光光度法测定其含量,采用正交设计的实验方法对苎麻根抗胃癌有效组分的最佳提取方法进行筛选;进一步采用大孔吸附树脂法,考察上样浓度、洗脱剂浓度、上样酸碱性、洗脱的速度几个因素对苎麻根有效组分的纯化工艺的影响,来筛选出苎麻根抗胃癌有效组分的最佳纯化方法。2.通过MTT法检测苎麻根有效组分对人胃癌HGC-27细胞的增值抑制作用,以明确苎麻根有效组分体外抗胃癌药效。3.采用高效液相色谱法建立苎麻根有效组分指纹图谱,并进行成分的含量检测,建立10个不同产地的苎麻根有效组分指纹图谱,进一步应用液质联用的方法对苎麻根有效组分进行成分表征,在此基础上进一步对其进行多指标成分定量分析为苎麻根药材的质量控制提供一定的参考价值。4.应用流式细胞仪通过Annexin V-FITC/PI双染色法及PI单染色法进行检测,探讨苎麻根有效组分诱导人胃癌细胞HGC-27周期分裂及凋亡坏死的影响。通过细胞划痕实验及Transwell小室实验探讨苎麻根有效组分诱导人胃癌细胞HGC-27迁移侵袭的影响。以小鼠巨噬细胞为研究对象,研究苎麻根有效组分对免疫细胞的调节作用。采用qPCR相关技术,检测苎麻根有效组分对人胃癌细胞HGC-27中调控细胞周期凋亡、迁移侵袭相关基因相对表达量的影响,进一步阐释苎麻根抗胃癌的初步作用机制。结果:1.得到苎麻根抗胃癌有效成分的效果最好提取方法为:采用加热回流的提取方法,用15倍量浓度为50%的乙醇对苎麻根黄酮类组分提取2次,每次1小时;得到苎麻根抗胃癌有效物质组分的最佳纯化工艺条件为:HPD-100型大孔吸附树,以0.225 g/mL(药材/湿树脂)的浓度上柱苎麻根提取液,用2 BV水洗除杂,用6BV 70%乙醇洗脱,收集洗脱液,水浴蒸干,即得苎麻根抗胃癌有效物质组分的富集物。优选出的最佳纯化工艺使苎麻根抗胃癌有效物质组分纯度达到了83%左右。2.苎麻根有效物质组分能显著的抑制人胃癌细胞HGC-27的增殖的作用,且呈现良好的时间-剂量-效应关系,提示苎麻根有效物质组分具有较好的体外抗胃癌药效。3.通过HPLC-Q-TOF-MS对苎麻根有效组分中所含化学成分分析,共鉴定了7个化学成分。建立了10个不同产地的苎麻根有效组分全时段三波长融合指纹图谱,相似度评价分析表明不同产地药材间相似度存在一定差异性。同时对苎麻根有效组分中4个成分的进行含量测定。4.通过GC-MS共解析出苎麻根石油醚部位中26种化学成分,主要为甾醇类(37.228%)、酯类(21.445%)、酸类(21.315%)、酚类(1.245%)、蒽醌类(0.882%)等化合物。本实验检测出苎麻根石油醚部位甾醇类谷甾醇和豆甾醇总含量为33.2%、棕榈酸含量为6.5%。5.通过流式细胞仪对细胞凋亡的检测结果显示,苎麻根有效组分能够诱导人胃癌HGC-27细胞凋亡,并且随着给药浓度的加大,细胞凋亡比例也逐渐增大;通过流式细胞仪对细胞周期的检测的结果显示,苎麻根有效组分作用于人胃癌HGC-27细胞后使细胞主要阻滞于S期,从而影响细胞周期的正常进行,抑制细胞的增值。6.本实验采用细胞划痕实验检测苎麻根有效组分作用于人胃癌HGC-27细胞后对其迁移能力的影响,结果显示与空白对照组相比,苎麻根有效组分能显著抑制人胃癌HGC-27细胞的迁移。采用Transwell小室法检测苎麻根有效组分作用于人胃癌HGC-27细胞后对其侵袭能力的影响,结果显示,苎麻根有效组分对胃癌HGC-27细胞的侵袭能力具有显著的抑制作用,差异具有统计学意义(F=58.7,P<0.05)。随着给药浓度的增高,苎麻根有效组分抑制胃癌细胞迁移侵袭的能力越来越强,呈剂量依赖性。7.本实验以小鼠巨噬细胞为研究对象,研究苎麻根有效组分对免疫细胞的调节作用,结果显示苎麻根有效组分可以通过促进细胞增殖活化,促进NO的分泌,使其在免疫过程中及抑制杀死肿瘤细胞的过程中起到关键的作用,还可以通过吞噬外来的微生物或病毒来减少机体受到外来病毒入侵的风险,初步提示苎麻根有效组分可以发挥免疫调节作用,为后苎麻根药材在免疫调节及抗肿瘤方面的研究及开发提供一定的依据。8.qPCR结果显示,不同浓度的苎麻根有效组分均不同程度的影响了人胃癌细胞HGC-27中调控细胞周期、凋亡、迁移、侵袭相关基因Bax、Bcl-2、caspase-3、cyclin-E、CDK-2、PTEN、MMP9、VEGF、AKT、PI3K的mRNA表达。其中,抑癌基因PTEN和促凋亡基因Bax的相对表达量增加,抗凋亡基因Bcl-2、caspase-3、cyclin-E、CDK-2、PTEN、MMP9、VEGF、AKT及PI3K相对表达量减少。结论:1.采用正交实验设计法及大孔吸附树脂法,得到苎麻根抗胃癌有效物质组分的最佳提取及纯化方法,优选出的最佳提取纯化方法为苎麻根抗胃癌有效成分的基础研究及初步作用机理研究提供了一定的参考。2.通过体外抗肿瘤效学实验研究,结果显示苎麻根有效组分具有良好的抗胃癌的作用。3.本研究通过高效液相色谱法以及相似度评价软件得到苎麻根有效组分整体特征指纹图谱,在此基础同时基于全时段三波长融合指纹图谱建立了苎麻根有效组分多指标成分的定量方法,从而较完善地反映苎麻根药材中药材的内在质量。该检测方法稳定、可靠,进一步为苎麻根药材的质量控制以及评价体系提供一定的参考价值。4.利用流式细胞术来研究苎麻根有效组分对人胃癌HGC-27细胞凋亡和周期的影响,采用胞划痕实验及Transwell小室实验探讨苎麻根有效组分诱导人胃癌细胞HGC-27迁移侵袭的影响,实现对苎麻根抗胃癌作用机制的初步探讨。5.由于近年来中药通过免疫调节作用来影响肿瘤细胞的发生发展,因此本实验以小鼠巨噬细胞为研究对象,发现苎麻根有效组分对免疫细胞具有一定的调节作用,为其今后是否通过免疫调节进一步对抗肿瘤方面产生影响提供一定的基础。6.中药苎麻根抗胃癌有效组分具有明显调控PI3K-AKT信号通路的作用,调节细胞周期凋亡、迁移侵袭相关基因的表达,抑癌基因PTEN和促凋亡基因Bax的相对表达量增加,抗凋亡基因Bcl-2、caspase-3、cyclin-E、CDK-2、PTEN、MMP9、VEGF、AKT及PI3K相对表达量减少,有效地控制了肿瘤细胞的增殖与生长,为明确抗癌药物的作用机制提供了一定的实验依据。