背景与目的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,M.pneumoniae)是引起社区获得性呼吸道感染的常见病原体之一,可导致支气管炎和非典型肺炎,并可引起多种肺外并发症。近年来,多个国家和地区报道肺炎支原体的感染率和耐药率都有所升高,严重危害儿童和青少年的健康。以往研究显示肺炎支原体对大环内酯类药物耐药严重,目前还未有报道对四环素类和喹诺酮类抗生素耐药的临床分离株,但随着喹诺酮类及四环素类抗生素的应用,肺炎支原体耐药株可能也会出现。本研究1、拟通过检测2014年1月至2014年12月间北京地区收集的儿童咽拭子标本,了解2014年度北京地区儿童肺炎支原体流行及耐药情况及特点;2、拟通过实时定量PCR技术(SYBR Green染料法)建立一种快速、特异、敏感、经济、准确检测肺炎支原体的方法,并评价其在临床上的应用价值。方法1、儿童肺炎支原体流行及耐药监测2014年1月至2014年12月间,从北京地区十一家医院收集呼吸道感染患儿咽拭子标本,进行接种培养和测定最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),并提取DNA,检测耐药相关基因,监测M.pneumoniae感染及耐药情况。2、实时定量PCR方法的建立及临床应用选择肺炎支原体的23S rRNA耐药相关基因作为扩增区,设计特异性引物,然后提取相应质粒作为标准品,建立绝对定量的标准曲线。比较荧光定量PCR方法与传统巢式PCR方法和市售试剂盒的特异性和灵敏度;分别利用上述三种方法和培养法检测临床咽拭子样本,进行相关系数、符合率及kappa系数的分析。结果1、儿童肺炎支原体流行及耐药监测(1)2014年共收集北京地区呼吸道感染患儿咽拭子标本827份,有效标本822份。23srrnav区巢式pcr扩增阳性标本341例,阳性率为41.48%。其中,敏感株105株(30.79%),耐药株236株(69.21%),包括a2063g位点突变199株(58.36%),a2064g位点突变25株(7.33%),同时发生a2063g、a2064g位点突变12株(3.52%)。分离培养阳性标本共99株,培养阳性率29.03%。(2)2014年肺炎支原体感染率呈下降趋势,耐药率仍以春冬季最高;感染率随年龄增长呈上升趋势,以学龄期最高;不同性别肺炎支原体阳性率及耐药率均无统计学差异。(3)不同诊断中,肺炎患儿肺炎支原体检出率和耐药率均明显高于上感、支气管炎患儿;支气管炎和肺炎患儿中肺炎支原体培养阳性率均明显高于上感,但支气管炎和肺炎患儿间未发现统计学差异。(4)测定临床分离株mic显示,8株测序敏感株对大环内酯类、四环素类和喹诺酮类抗生素均敏感,57株测序耐药株对大环内酯类抗生素敏感,对四环素类和喹诺酮类抗生素均敏感。2、实时定量pcr方法的建立及临床应用(1)构建标准品得标准曲线,其线性方程表达式为:y=-3.5692x+40.786,r2=0.998。(2)在灵敏度检验中,实时定量pcr和巢式pcr均为10拷贝,市售试剂盒为100拷贝;在特异性检验中,m.pneumoniae检测为阳性,人型支原体和其他4种细菌均检测为阴性。(3)临床样本检测中,经统计学分析,实时定量pcr和巢式pcr、市售试剂盒、分离培养法的总符合率均>80%,kappa系数均>0.65;实时定量pcr方法与市售试剂盒检测结果的相关系数r=0.923,p<0.001。结论1、儿童肺炎支原体流行及耐药监测(1)2014年北京地区儿童肺炎支原体感染率和23srrnav区突变率有所降低,感染率随年龄增长呈上升趋势,以学龄期最高,但无明显性别差异,与国内外报道相符。(2)肺炎支原体临床分离株对大环内酯类抗生素耐药严重,耐药机制仍以23S rRNA V区位点突变为主,包括A2063G、A2064G、两个位点同时突变三种情况,而对四环素类、喹诺酮类抗生素敏感。2、实时定量PCR方法的建立及临床应用实时定量PCR方法检测肺炎支原体,灵敏度高,特异性强,与巢式PCR、市售试剂盒、分离培养法比较,快速经济,污染少,不受患儿年龄、疾病病程和机体免疫功能等的限制,具有很大的科研和临床实用价值。