马尾松CAD和CCoAOMT基因的克隆与表达分析

来源 :南京林业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:jimchenstong
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CAD和CCoAOMT都是木质素生物合成中所需的酶,已证实在木质素单体的合成中发挥重要的作用。马尾松是我国南方的重要用材树种,但至今未见关于其CAD和CCoAOMT的研究报道。本文研究了马尾松中的两基因,结果如下:1、本研究利用CODEHOP设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,从马尾松茎中克隆出CAD和CCoAOMT的cDNA全长,GenBank登入号分别为:KF419291和KF419292。PmCAD的cDNA全长1450bp,包括1074bp完整的ORF,编码357个氨基酸的蛋白,所编码蛋白质的分子质量与等电点分别为38945.1u和5.8;PmCCoAOMT的cDNA全长1126bp,包括780bp完整的ORF,编码259个氨基酸的蛋白,所编码蛋白质的分子质量与等电点分别为29068.3u和5.12。利用MEGA5.0、DNAMAN、ANTHEPROT等软件分析核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。组织特异性分析结果,马尾松CAD和CCoAOMT在嫩枝、根、叶和新芽中有不同程度的表达,其中在嫩枝中的表达丰度最高,在根和叶中次之,在新芽中的表达丰度最低。2、PmCAD和PmCCoAOMT植物反义表达载体的构建以及在转基因植物中的表达。PmCAD和PmCCoAOMT分别反向插入表达载体pBI121中,采用液氮冻融法将载体导入农杆菌EHA105中,用烟草叶盘做外植体材料将构建的反义表达载体转入烟草中,Klason法测定植株中的木质素含量,测定结果表明,将PmCAD基因反向转入的烟草相对于野生型烟草中平均木质素含量降低较少,将PmCCoAOMT基因反向转入的烟草相对于野生型烟草中平均木质素的含量降低了6.6%,两种转基因植物长势没有太大区别。3、PmCAD基因的原核表达载体的分析。成功构建了PmCAD基因的原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,并对原核表达载体的外源诱导条件进行优化分析。诱导表达优化结果说明马尾松CAD在pH为7,温度为37℃,IPTG为6.0时诱导3h较好。并测得PmCAD基因在外源诱导表达的蛋白质分子质量约为39KDa。
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