背景与目的格列卫（甲磺酸伊马替尼，STI571）是一种酪氨酸激酶抑制剂，可抑制Bcr-Abl融合基因中Abl基因的酪氨酸激酶活性，从而特异性抑制费城染色体阳性（Ph⁺）细胞增生和诱导细胞凋亡。2001年5月美国FDA批准其作为慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia；CML）患者在急变期、加速期或慢性期干扰素-a治疗失败后的一种口服治疗方案；2003年5月进一步获批准用于各期CML。国内近两年应用亦较多。现已被公认为目前治疗慢性粒细胞白血病的一线药物。但临床研究注意到，有相当一部分起初对STI571治疗有反应的CML患者，较快出现了耐药；即便是慢性期患者，也有45％～50％的患者在治疗前9个月未能获得遗传学缓解，即出现了遗传学耐药。最近的研究已经提示，这种耐药现象的发生可能是Bcr／Abl阳性细胞发生Bcr／Abl基因扩增或过度表达的结果；再者，MDR₁基因及其产物P-糖蛋白的过度表达也可能与耐药形成有关。然而，这些观点也许只能用以解释小部分临床上CML对STI571的耐药现象。越来越多的证据提示，CML起源于CML的白血病干细胞（leukemia stem cell；LSC），其分化出的相对成熟的子代细胞构成了白血病细胞的主体，STI571对这部分白血病细胞具有明显的生长抑制作用，但慢性粒细胞白血病干细胞对STI571可能是部分、甚至是完全耐药。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol—13-acetate；TPA）是一种从巴豆油中提取的蛋白激酶C（protein kinase C；PKC）激活物，具有最高的促癌活性同时也是最强的诱导分化剂之一。它具有诱导恶性肿瘤细胞分化、促进淋巴细胞转化和淋巴因子分泌的作用，自1979年Huberman等发现人早幼粒细胞可被TPA诱导分化以来，已被广泛应用于诱导分化实验研究，它可诱导HL-60、HEL等多种白血病细胞株细胞的分化，促使除巨核系祖白血病细胞株外的上述细胞向单核／巨噬细胞分化，出现单核／巨噬细胞的某些表型和功能，以及酶学的变化。已有文献报道TPA对原代白血病细胞有诱导分化作用，以向单核／巨噬样细胞分化为主，且不同分型病例对TPA诱导反应强弱不同，同一分型不同个体之间也存在着一定差异。在体外，低浓度(10^-6mol／L～10^-8mol／L)的TPA对小鼠和人多种白血病细胞系具有强烈的诱导分化作用，临床上也观察到TPA对难治／复发白血病有一定疗效。最近，我们从慢性粒细胞白血病患者的骨髓中分离出一Bcr／Abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1⁺CD34^-细胞群体，体外实验证实该细胞可在单细胞水平上同时向造血细胞及内皮细胞分化，且分化出的细胞均表达Bcr／Abl融合基因。这就提示我们所分离出的具有血液血管干细胞特性的Flk1⁺CD34^-细胞可能是慢性粒细胞白血病的干细胞。在本研究中，我们利用Flk1⁺CD34^-细胞，初步探讨了STI571对处于不同分化阶段的慢性粒细胞白血病干／祖细胞的敏感性，旨在进一步了解STI571对CML患者体内Bcr／Abl融合基因阳性的原始及处于分化阶段的白血病干／祖细胞分化和增殖的影响，从而更深入阐明部分CML患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对STI571耐药的机制；并且初步探讨了TPA联合STI571克服CML患者对STI571耐药现象的可能，从而为临床采用TPA联合STI571克服CML耐药现象提供理论依据。对象与方法1．病例选择：选择CML患者15例（Ph⁺），均为男性，年龄19～65岁，均处于CML慢性期，就诊前均没有接受过羟基脲或干扰素治疗。具体资料见表1；2．Bcr／Abl⁺Flk1⁺CD31^-CD34^-慢性粒细胞白血病干细胞的分离：淋巴细胞分离液分离CML患者骨髓单个核细胞，免疫磁珠分选CD45^-、GlyA^-及CD34^-细胞，极限稀释法获得单克隆细胞并检测其生物学特性；3．Bcr／Abl⁺Flk1⁺CD31^-CD34^-慢粒白血病干细胞耐药性检测：体外检测STI571对Bcr／Abl⁺Flk1⁺CD31^-CD34^-细胞在造血集落培养基中分化及处于不同分化阶段时的增殖抑制及促凋亡作用；采用流式细胞术将Bcr／Abl⁺Flk1⁺CD31^-CD34^-细胞分为三个亚群，即G₀期、G₁期及S／G₂+M细胞，分别评估TPA单独应用、STI571单独应用及TPA联合STI571对三个亚群细胞的体外增殖及凋亡的影响。结果1．浓度为5μM STI571，维持作用96小时（病人体内维持96小时的STI571浓度只可能达到1～2μM），即可有效抑制定向造血祖细胞的增殖；没有充分的证据显示相对原始的Bcr／Abl融合基因阳性、免疫表型为Flk1⁺CD34^-的细胞的分化及增殖受到明显的抑制作用；2．G₀期Bcr／Abl⁺Flk1⁺CD31^-CD34^-细胞对STI571的耐药性明显强于G₁期及S／G₂+M细胞；TPA联合STI571可明显增强STI571对Bcr／Abl⁺Flk1⁺CD31^-CD34^-细胞的增殖抑制及促凋亡作用。结论1．STI571也许不能清除体内相对原始的CML白血病干细胞；STI571对相对原始的CML白血病干细胞不敏感可能是STI571产生临床耐药及CML复发的一根本原因；2．TPA和STI571联用可有效增强STI571对CML白血病细胞、尤其是处于G₀期的CML白血病干细胞的清除作用；TPA和STI571联用也许不失为一种进一步改善STI571对CML疗效的临床方案。