忍冬桑黄发酵产黄酮类化合物的研究

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桑黄(Sanghuangporus)是一类传统的药用真菌,具有较好的免疫增强和抗肿瘤功效。黄酮类化合物是一种高含量的次生代谢物,主要存在于桑黄的菌丝和子实体中。人体所需的黄酮类化合物无法通过自身合成,只能从食物中获取,黄酮的生理功能对人类的健康有很大的作用。近年来,随着人们对人体健康的认识日益提高,利用食用菌作为原料进行黄酮提取的研究,不仅越来越受到重视,且逐渐成为当今营养学领域的一个重要课题。忍冬桑黄(S.lonicericola)是桑黄的一种,目前对其研究较少,作为新鉴定出来的菌种,其中黄酮类化合物含量和种类尚不明确,因此,本文对忍冬桑黄发酵产黄酮类化合物进行了研究。主要研究内容及结果如下:1.胞内黄酮提取方法首先选用乙醇回流法直接提取,获得忍冬桑黄黄酮得率为4.39 mg/g,提取效果不理想。后面选择超声波辅助乙醇提取法,并对其进行提取优化。利用单因素实验和响应面实验,优化忍冬桑黄菌丝体中总黄酮的提取工艺,获得提取最优工艺为:超声时间60 min、超声功率278 W、乙醇体积分数92%、液料比49.5(mL/g)。经验证,在该条件下,忍冬桑黄菌丝体总黄酮的提取得率为14.6 mg/g,是采用单纯乙醇提取法得率的3.3倍。2.探索了忍冬桑黄产黄酮最佳发酵培养模式。将摇床-无摇静态两阶段结合的发酵模式和摇床培养模式进行对比,以菌丝体生物量和胞内黄酮总含量作为考察标准,结果显示,培养模式为摇床培养7天-无摇静态培养2天时,所得胞内黄酮含量最高,达到55 mg/L,与用摇床培养9天(47 mg/L)相比有所提高,因此选择了该模式,但在此模式下黄酮含量依旧较低。于是对忍冬桑黄发酵产黄酮类化合物的发酵条件进行优化,其中单因素实验选择了五个因子(接种量、培养温度、摇床转速、初始pH值、装液量),响应面优化选择了其中三个影响最大的因子(接种量、培养温度、初始pH),经响应面优化后,获得最佳发酵条件:接种量14.5%(v/v)、培养温度28.6℃、初始pH 10.6。该条件下忍冬桑黄菌丝体总黄酮的提取得率达到23.99 mg/g。优化后的忍冬桑黄胞内黄酮含量23.99 mg/g是未优化前(14.6 mg/g)的1.6倍,表明忍冬桑黄产黄酮发酵条件优化效果显著。3.对忍冬桑黄产黄酮发酵条件优化前后的黄酮粗提物进行了抗氧化活性对比,研究了 6种不同浓度的忍冬桑黄黄酮粗提液对DPPH、ABTS、羟自由基、超氧阴离子四种自由基的清除效果,并将其与VC进行了对比。结果显示:在发酵工艺优化前后,黄酮粗提液对DPPH、ABTS、羟自由基的清除作用,均处于良好水平。在优化前后忍冬桑黄黄酮粗提物对四个抗氧化指标的清除率都达到最大时的浓度下,优化后的忍冬桑黄黄酮粗提物对DPPH自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率分别达到52.7%和58.6%,相比优化前的46%和44%有所提高。优化后的忍冬桑黄黄酮粗提物对羟自由基清除率为43.2%,比优化前的61.3%有所下降。当忍冬桑黄黄酮粗提物浓度达到1 mg/mL时,对ABTS自由基的清除能力都达到了约90%,但优化前后的清除能力并无明显区别。4.通过UPLC-MS/MS共检测到忍冬桑黄菌丝体中共49种黄酮类化合物,主要分为:二氢黄酮醇、二氢黄酮、查耳酮、黄酮、异黄酮、黄烷醇类、黄酮醇七类。除此外,本章还分析了其中16种黄酮类单体化合物,通过查找文献发现这些化合物具有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗炎、抗真菌、保肝护肝等作用,通过ChemSpider找出了这16种化合物的化学结构,发现其都具有黄酮基本母核,证明其属于黄酮类化合物。本论文探究了忍冬桑黄胞内总黄酮最优提取工艺和忍冬桑黄产黄酮最优发酵条件,提高了忍冬桑黄生产黄酮类化合物的产量,为忍冬桑黄液体深层发酵产黄酮的工业化生产奠定了基础。相关抗氧化活性的检测研究,为后续对忍冬桑黄黄酮的深入研究提供了理论参考。
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