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香菇C91-3菌株是我课题组经多年筛选得到的一株药用真菌。目前，本课题组已证实香菇C91-3菌株发酵液粗提蛋白能够诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与调控细胞周期有关。以此为依据，经香菇C91-3菌株转录组学分析初步筛选出17条与细胞凋亡相关的功能基因，利用RACE技术获得其基因序列全长及对应的蛋白质序列。本研究关注的是17条功能基因的第二条基因，命名为—latcripin-2基因（简称为LP-2）。目前，我们已经成功地将选定的目的蛋白在GenBank进行了序列注册（Accession Number：KF668033）。目的：本研究通构建香菇C91-3菌株pET32a(+)-latcripin-2表达载体，使其在大肠杆菌Ecoli. Rosetta-gami(DE3)中进行重组表达，并通过对其生物学活性的检测来找到香菇中最具抗肿瘤作用的功能蛋白。①寻找并确定香菇C91-3菌株中凋亡相关蛋白Latcripin-2的基因序列及功能基团。②通过构建原核表达载体将香菇C91-3菌株凋亡相关蛋白Latcripin-2在大肠杆菌Ecoli. Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达，同时对表达产物进行鉴定。③通过诱导表达香菇C91-3菌株凋亡相关蛋白Latcripin-2，研究其对人肺癌细胞A549的生物学功能影响，为探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的机制打下良好的基础。方法：①从香菇C91-3菌株菌丝体中提取总RNA，根据转录组测序结果，用3’-Full RACE (Rapid Amplificatioon of cDNA Ends，RACE)、5’-Full RACE方法获得latcripin-2基因，通过生物信息学软件分析Latcripin-2蛋白理化性质、氨基酸组成及二级结构，并预测其功能结构域。②将latcripin-2的功能域基因Pkinase克隆到原核表达载体pET32a(+)中，构建原核重组表达质粒pET32a(+)-latcripin-2，将此质粒转化到大肠杆菌Ecoli. Rosetta-gami(DE3)中并进行诱导表达，对表达产物用Western blot方法进行鉴定。用亲和层析的方法分离纯化该目的蛋白，测定蛋白浓度。③将已鉴定的各浓度的诱导表达蛋白作用于人肺癌细胞A549，用MTT(MethylThiazoly LtetraZolium，MTT)法测定目的蛋白的抑瘤率；用流式细胞术检测目的蛋白对肿瘤细胞的凋亡作用及细胞周期的影响；用电镜法检测其对各肿瘤细胞形态学影响。结果：①通过双酶切确定插入pET32a(+)中的片段为latcripin-2基因片段。通过对Latcripin-2进行蛋白结构域的分析，发现其蛋白三级结构含有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶结构域(Pkinase)。②Western blot结果显示大肠杆菌Ecoli. Rosetta-gami(DE3)所表达的蛋白为Latcripin-2蛋白。Bradford法测定表达蛋白浓度结果显示，R2=0.9921，得到直线方程y=0.0299x+0.123。③MTT法检测结果显示，不同浓度此蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用与对照组比较差异均有显著性意义（P＜0.05）；流式细胞术结果显示，此蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，浓度为200μg/ml时诱导凋亡的作用最强，终浓度为100μg/ml、200μg/ml的此蛋白对肿瘤细胞凋亡作用与对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。细胞周期检测结果显示，在200μg/ml Latcripin-2蛋白作用下，G0/G1期与G2/M期所占比例明显升高，S期所占比例明显降低，细胞生长多停滞于G0/G1。结论：①对获得的香菇C91-3菌株的转录组序列进行比对，根据基因功能注释初步结果，用3’-Full RACE、5’-Full RACE方法成功获得了latcripin-2基因全长。②成功构建了重组质粒pET32a(+)-latcripin-2；目的凋亡相关蛋白Latcripin-2在大肠杆菌Ecoli. Rosetta-gami(DE3)中成功表达；表达蛋白Latcripin-2经亲和层析被成功纯化。③Latcripin-2蛋白对人肺癌细胞A549具有诱导凋亡作用，其具体机制有待深入研究。本实验为进一步深入揭示香菇C91-3菌株的抗肿瘤机制奠定了基础。