目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是危害人类健康的最严重问题之一。HBV具有全球流行性,我国的流行率虽从1992年的9.75%下降到2006年的7.18%,但我国慢性HBV感染者仍有9300万人,慢性乙型肝炎患者约2000万人,每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡的人数约有30多万人,新发乙型肝炎有50-100万例。有研究发现,经输血传播HBV的风险明显高于丙型肝炎病毒与艾滋病病毒,其风险主要来自血清转换前的窗口期、变异病毒株与隐匿性乙型肝炎病毒3个方面。近来发现乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的患者体内也存在着HBV DNA,部分HBsAg-/HBV DNA+的献血者可引起输血传播,严重影响了输血安全,这种HBsAg-/HBV DNA+的感染称为隐匿性乙型肝炎感染(OBI)。2008年欧洲肝病研究协会(EASL)隐匿性HBV感染国际工作组对OBI进行了定义：将采用现行可利用的方法在肝脏中检出HBV DNA、血清(浆)中检出或检不出HBV DNA、HBsAg阴性的个体定义为OBI。在实际操作中,肝脏较难获得且检测难度较大,影响因素较多,因此,OBI定义为：机体存在乙肝病毒DNA,但无法检测到乙肝病毒表面抗原的HBV感染,可伴有或不伴有乙肝病毒核心抗体(抗-HBc)或者乙肝病毒表面抗体(抗-HBs)。HBV可分为A-H8个基因型,其分布具有明显的地域性,也与人种有关。欧洲北部、西部以及美国主要为A型,B、C型主要分布于亚洲,而D型分布最广,我国北方地区以C基因型为优势株,南方地区B型最常见。OBI的发生与发展机制现在仍然不清楚,可能机制包括：(一) HBsAg和抗-HBs结合形成了免疫复合物；(二)变异体的形成影响了HBsAg编码区S基因对“a”抗原决定簇的编码；(三)与其它肝炎病毒合并感染可能影响了HBV的复制,减少了HBsAg的合成。HBsAg的检测作为我国HBV检测的唯一指标,核酸检钡(?)(nucleic acid test,NAT)还没有纳入法定项目,输血存在HBV窗口期感染和OBI感染的输血残余风险,国内对B、C型OBI的研究停留在起步阶段,没有详细的OBI流行病学调查,关于B、C型OBI的分子生物学特性的分析也只有零星的报道,没有进行进一步详尽的研究,本课题对我国B、C型OBl分子生物学的研究具有重要意义：1,调查我国深圳地区OBI的流行情况；2,探讨我国B、C型OBI的分子生物学特征；3,为OBI基因型B和C的监测与防控策略提供重要依据,改进血液安全筛查方法；4,为OBI的临床发生、发展和个性化治疗方案提供理论指导。材料：2010年4月-2012年12月深圳市血液中心采集的310,167份无偿献血者标本,其中初次献血者114,761份,占37%,重复献血者195,406份,占63%,所有标本经过表面抗原(胶体金试纸)与ALT(罗氏干式生化分析仪)初筛,然后进行酶免法(EIA)法和多联病毒核酸筛查技术检测。方法：(1)无偿献血者样本经进口和国产两种试剂进行HBsAg的检测,经美国诺华公司的TIGRIS全自动血液核酸检测仪进行三联荧光病毒单人份检测,使用化学发光法(CMIA,雅培)进行HBsAg的确认。(2)用QPCR方法进行HBsAg-/DNA+样本HBV病毒载量的测定。(3)对HBsAg-/DNA+样本进行基本核心启动子／前C区(BCP/PC)、HBV全基因、Pre-S/S区、S区、Pre-C/C区的巢式PCR的扩增,PCR产物送公司测序。(4)从GeneBank基因数据库挑选我国B型和C型HBV野毒株作为OBI变异株的参考序列；使用MEGA软件分析OBI的S区序列以确定基因型。(5)将OBI样本全基因序列分为Pre-S/S、Pol、 X、Pre-C/C,每个区核苷酸翻译成蛋白序列后和相应基因型的野毒株进行序列比对分析。(6)与野毒株基因序列比对,分析OBI毒株全基因序列调控元件变异特点以及引起的HBV生物学特征改变,包括启动子区域(SP1、SP2、CP、XP)、转录调控序列区(CURS、DR1、DR2、和NRE)、增强子区(ENH1和ENH2)。(7)统计学处理：采用SPSS(13.0)统计分析软件,以Pearson Chi-Square检验分析变量数据,比较OBI序列中氨基酸与调控序列的变异率与野毒株序列的差异；以Mann-Whitney U检验分析连续变量数据,比较两组样品HBV DNA病毒载量的差异；所用的统计检验均采用双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.OBI样品的分类与鉴定：(1)从310,167份无偿献血者标本中共筛查出121份HBsAg-/DNA+样本,其中6例样品(SZ81、SZ82、D1、D3、D7、D17)确定为假阳性样本,有4例样品(SZ7、SZ10、SZ31、SZ33)经追踪后发现HBsAg转为阳性,有12例样品(SZ16、SZ21、SZ22、SZ54、SZ55、SZ80、D5、 D6、D10、D15、D21)5项血清学标志物为阴性,同时缺乏追踪数据,为窗口期样本或原发OBI,其余99例HBsAg-/DNA+样品确定为OBI。深圳市的OBI感染率为1：3133(99/310167)；(2)99份OBI样本中扩增出91例BCP/PC、20例全基因、31例Pre-S/S、18例S、55例Pre-C/C。99例OBI样品S区经软件MEGA进行系统进化分析,其中B型有57例,C型12例,还有30例OBI样品未能定型。在99例OBI样品中,男性72人,女性27人,ALT水平正常(<40),HBsAb阳性HBcAb阳性的有31例(31%),病毒载量范围介于不能定量(<1IU/m1)到798.7IU/ml(中位数为61.8IU/ml)。HBsAb阳性HBcAb阴性的有12例(12%),病毒载量介于不能定量(<1IU/m1)到1205IU/ml(中位数为63.87IU/ml)。HBsAb阴性HBcAb阳性有53例(54%),病毒载量介于不能定量(<1IU/m1)到1062IU/ml(中位数为53.86IU/ml)。HBsAb阴性HBcAb阴性的有3例(经追踪,3%),病毒载量介于13.35-5506IU/ml,中位数101.2IU/ml。OBI样品年龄为20-56岁,中位数为35岁,病毒载量介于不能定量(<1IU/m1)到2122IU/ml(中位数为27.9IU/m1),窗口期样品年龄为19-41岁,病毒载量介于不能定量(<1IU/m1)到2782IU/ml(中位数为63.5IU/ml)。2.OBI毒株调控区序列变异分析：(1)B型和C型OBI毒株的DR1、DR2和NRE区域高度保守；(2)B型和C型的SP1、SP2、ENH1和ENH2的核苷酸变异率与野毒株对比有显著性差异(P<0.05)；(3)B型OBI毒株CURS区域核苷酸变异率与野毒株对比有显著性差异(P=0.037)；(4)C型OBI毒株BCP区域核苷酸变异率与野毒株对比有显著性差异(P=0.002)。B型OBI毒株中BCP区域有40%的样品出现第1752位核苷酸的突变,38%的样品出现CURS区域内第1726核苷酸的突变。C型OBI样品中有31%的样品出现第1799位核苷酸的突变,46%样品出现CURS区域内第1727位氨基酸的突变,没有出现缺失和插入,同时也没有发现第1762位与第1764位核苷酸的突变。3.OBI基因组蛋白序列变异分析：(1)Pre-S/S蛋白氨基酸序列,B型和C型OBI毒株氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P<0.0001)。C基因型毒株中Pre-S1区域的氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P<0.0001),B型OBI毒株Pre-S2和S区域氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P<0.05),MHR是突变发生的频繁区域。B型和C型OBI毒株氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P<0.05),B型OBI毒株中突变主要集中在aal30-aal34之间,频率最高的是F134I/L和G130R/A,分别出现13次(18%)和9次(12%),样品SZ5、SZ98和D11分别在MHR区域的aa121、aa118和124处插入氨基酸SPPTGTGS、 IPGSPPTG和PR,样品SZ17在aa185处出现终止密码；(2)P蛋白氨基酸序列,B型和C型OBI毒株氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P<0.001)。P蛋白的重要功能区YMDD和FLLA区均高度保守,47%的B型OBI样品中出现了K73N、V458D/A、A568T的突变。3个C型OBI毒株都发生了E73D的突变,SZ5该样品在第471氨基酸处插入NSRTITTNP9个氨基酸,样品SZ15在第477氨基酸处插入氨基酸TQ；(3)Pre-C/C蛋白氨基酸序列,C型OBI毒株氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P=0.034),29%的B型OBI毒株出现了G1896A的变异,C型OBI毒株中也出现4个该突变,从而使aa28出现终止密码子,阻止HBeAg的翻译。样品SZ28、SZ39和D14分别出现了第1839位、第1876位和第1841-1845位核苷酸的缺失,导致了移码突变,出现终止密码；(4)X蛋白氨基酸序列,B型和C型OBI样品氨基酸突变率与野毒株对比有显著性差异(P<0.0001)。结论：本实验从310,167份无偿献血者血样中筛查出121份HBsAg-/DNA+样品,其中99份确认为OBI样品,深圳地区OBI的流行以B基因型占多数。Pre-S/S蛋白氨基酸的插入、MHR区域氨基酸的突变、Pre-C/C蛋白氨基酸的终止以及众多调控序列的突变都可能影响了HBV的复制与蛋白的表达,与OBI的发生和发展有密切关系。本研究结果为改进血液安全筛查方法,以及为OBI临床发生、发展和个性化治疗方案提供了重要数据。