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背景与目的新生小鼠免疫功能尚处于进一步完善和成熟阶段。胸腺是T细胞发育分化的中枢免疫器官,脾脏是成熟免疫细胞定居的外周免疫器官。T细胞在小鼠胸腺的分化起始于骨髓来源的共同淋巴细胞前体(common lymphocyte precursor,CLP),CLP进入胸腺以后,经历双阴性胸腺细胞(double negative thymocyte,DN)、双阳性胸腺细胞(double positive thymocyte,DP)到单阳性胸腺细胞(single positive thymocyte,SP)的分化成熟过程。其中DN细胞分为CD44+CD25-DN1细胞、CD44+CD25+DN2 细胞、CD44-CD25+DN3 细胞和 CD44-CD25-DN4 细胞。DN4细胞再进一步分化为CD4+CD8+DP细胞,随后与胸腺上皮细胞表达的MHC Ⅰ类或MHC Ⅱ类分子及自身抗原肽相互作用,经历阳性选择和阴性选择,从而分化为成熟的SP胸腺细胞。SP细胞还需要在胸腺停留数日,才能分化为成熟T细胞,具有迁出胸腺的能力。已经证明,1-磷酸鞘氨醇受体 1(sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)可以以浓度依赖性的方式调节T细胞对趋化因子的趋化反应,辅助T细胞迁出胸腺。此外,CD62L和CCR7的表达也有助于成熟T细胞从胸腺迁出。外周成熟T细胞通过识别树突细胞和巨噬细胞提呈的抗原而活化,并分化为具有多种功能的CD4+/CD8+效应T细胞(CD62L-CD44hi)和记忆 T 细胞(CD62L+CD44hi)。感染一直是人类面临的重大疾病之一,尤其是近年来多种新发传染病的爆发流行,严重威胁人类生命健康并阻碍社会经济发展。同时,感染也是多种自身免疫性疾病的诱发因素。本课题组一直从事自身免疫病重症肌无力(myasthenia gravis,MG)发生机制的研究,关注到感染是MG发生的主要外部因素。有文献显示MG患者胸腺中与病原体识别有关的Toll样受体(Toll like receptor,TLR)表达增加,其中TLR3和TLR4过表达和通过这些受体的固有免疫应答过度激活可能是导致MG胸腺炎症和免疫失调的原因。多聚肌苷酸-胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly(I:C))是人工合成物,可模拟病毒双链RNA,脂多糖(lipopolysacchride,LPS)是细菌细胞外膜的成分,也是细菌内毒素。Poly(I:C)和LPS分别作为TLR3和TLR4的激动剂,可被固有免疫细胞识别和活化,poly(I:C)和LPS也常作为佐剂用于增强抗原的适应性免疫应答。多数MG患者胸腺异常,表现为胸腺异常增生、胸腺瘤等,胸腺中不仅T细胞亚群比例失常,而且出现能产生自身抗体的B细胞。这些MG胸腺异常是否与TLR表达增加相关,其作用机制也不清楚。本文通过观察poly(I:C)和LPS对于新生小鼠胸腺和脾脏T细胞、B细胞亚群的影响,分析感染作为自身免疫病发生诱导因素的可能机制。方法(1)研究对象与给药:8周大的C57BL/6小鼠,将6只雄鼠和12只雌鼠以1:2的比例进行合笼,使其怀孕,将孕鼠随机分四组:control组、poly(I:C)组、LPS组、poly(I:C)+LPS组。将小鼠与其母鼠同笼饲养。用胰岛素注射器对新生3d小鼠进行腹腔注射。Control组的每只新生小鼠注射50 μ1的无菌PBS,poly(I:C)组每只小鼠注射 10mg/kg 的 poly(I:C)、LPS 组注射 0.3mg/kg 的 LPS、poly(I:C)+LPS 组注射 10mg/kg 的 poly(I:C)和 0.3mg/kg 的 LPS,连续 7 天。在小鼠10d、21d大的时候,每组5只,断颈处死小鼠,取出胸腺、脾脏进行实验。(2)poly(I:C)和LPS对新生小鼠胸腺和脾脏中免疫细胞的影响:将小鼠的体重、胸腺与脾脏进行称重,把胸腺和脾脏细胞制成单细胞悬液并进行计数,胸腺分为3组分别加入抗小鼠CD3、CD19、CD4、CD8抗体;抗小鼠CD3、CD4、CD8、CD44、CD25 抗体;抗 CD3、CD4、CD8、S1P1 抗体。脾脏分为3组分别加入抗小鼠CD3、CD19抗体;抗小鼠CD4、CD8、CD44、CD62L抗体;抗CD4、CD8、S1P1抗体。用流式细胞仪检测。用FlowJo V10软件对流式结果进行圈门、分析。(3)统计学分析:用SPSS 21.0软件对所有的实验结果进行统计学分析,首先进行正态性检验,符合正态分布,使用单因素方差分析的方法进行分析,结果用均数±标准差来表示,当P<0.05时,可以认为差异显著,有统计学意义。实验结果(1)poly(I:C)和LPS对新生小鼠胸腺细胞亚群发育分化的影响:小鼠出生3d连续腹腔注射poly(I:C)、LPS,连续7d,分别对10日龄和21日龄小鼠胸腺进行分析,10日龄小鼠胸腺指数各组未见显著差异,21日龄小鼠poly(I:C)+LPS组胸腺指数升高(P<0.05);对胸腺细胞总数计数结果显示,10日龄小鼠LPS、poly(I:C)组和poly(I:C)+LPS组胸腺细胞总数显著低于对照组(P<0.05)。10日龄小鼠胸腺流式细胞分析结果显示,LPS组CD3阳性T细胞减少(P<0.05),对CD3阳性胸腺细胞亚群分析显示DN细胞和CD8SP细胞增多,CD4SP细胞减少,同时CD4SP细胞S1P1表达增加(P<0.05)。通过对DN细胞四个分化阶段分析,DN4细胞减少(P<0.05)。poly(I:C)组CD3阳性T细胞及其亚群未见显著差异,通过对DN细胞四个分化阶段分析,DN1细胞增多(P<0.05)。poly(I:C)+LPS组CD3阳性T细胞减少(P<0.05),对CD3阳性胸腺细胞亚群分析显示DN细胞和CD8SP细胞增多,CD4SP细胞减少(P<0.05)。通过对DN细胞四个分化阶段分析,DN1、DN3细胞增多、DN4细胞减少(P<0.05)。poly(I:C)使DN1细胞发育到DN2细胞的过程减慢,LPS使DN3细胞发育到DN4细胞的过程减慢。小鼠21日龄时再次分析,结果显示:poly(I:C)和LPS使小鼠胸腺的CD4SP细胞增多,CD4和CD8DP细胞减少(P<0.05)。再用CD44、CD25对DN细胞的分析表明,LPS组和poly(I:C)+LPS组的DN2、DN3细胞向DN4发育有所增加(P<0.05),可能是停止给药以后,胸腺细胞的发育得到一些恢复。LPS使CD4、CD8阳性T细胞的S1P1表达升高,poly(I:C)使CD8阳性T细胞的S1P1表达升高(P<0.05),这表明越来越多的T细胞成熟,并且迁出胸腺。(2)poly(I:C)和LPS对小鼠脾脏的影响:10日龄和21日龄小鼠LPS组和poly(I:C)+LPS组的脾脏指数升高(P<0.05)。10日龄小鼠脾脏的流式分析表明,LPS使CD4阳性的T细胞表达减少,与此同时,CD4单阳性细胞的S1P1表达的比例减少(P<0.05)。poly(I:C)使CD8阳性的T细胞表达增多(P<0.05)。poly(I:C)和LPS能够使CD19阳性的B细胞减少。poly(I:C)和LPS能够使CD4阳性的记忆T细胞、CD4阳性的初始T细胞、CD8阳性的初始T细胞减少(P<0.05)。poly(I:C)和LPS使21d的小鼠的脾脏肿大。LPS使CD4阳性T细胞数量减少,另外,LPS的刺激使CD4和CD8阳性的T细胞的S1P1的表达均升高(P<0.05)。poly(I:C)和LPS组CD3阳性的T细胞减少,其中的CD8阳性的T细胞减少,CD8阳性的初始T细胞、记忆T细胞以及CD4阳性的初始T细胞减少(P<0.05)。说明了在停药以后,将小鼠继续饲养至21d时,小鼠的胸腺的发育与迁出能力已经基本恢复,且有许多T细胞迁入脾脏,但小鼠的免疫细胞的功能尚未完全恢复。其中LPS的作用最显著。结论LPS和poly(I:C)导致新生小鼠早期双阴性(DN)胸腺细胞分化发育受阻,及成熟单阳性胸腺细胞比例变化,即CD8SP细胞增加和CD4SP细胞减少;LPS和poly(I:C)使成熟胸腺细胞S1P1表达增高,有利于细胞向外周迁移。脾脏淋巴细胞亚群分析结果显示LPS和poly(I:C)影响外周免疫器官CD4+/CD8+T细胞比值。提示新生期细菌、病毒感染可影响T细胞在胸腺的发育分化,并通过改变S1P1介导的成熟T细胞迁移而影响外周免疫器官脾脏中T细胞亚群的分布和功能。