人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)归属于逆转录病毒科中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)，即艾滋病。目前，艾滋病感染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题。研制有效的HIV疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成功研发显得尤为重要。　　 HIV-1反式激活蛋白(Trans-activator oftranscription，Tat)是HIV感染早期产生的一种重要调控蛋白，在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后，胞质中合成的Tat转移到核内，与多种转录调控因子结合组成转录起始复合体(transcription initiation complex，TIC)，促进病毒RNA的转录、延伸和病毒复制[1]。此外，Tat还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外发挥“病毒毒素”的作用：①通过诱导CD4+T细胞、NK细胞或B细胞的凋亡，发挥其免疫抑制的作用[2，3，4，5，6]；②通过JAK/STAT信号转导途经激活HHV-8的复制，或通过RGD(Arg-Gly-Asp)与内皮细胞αvβ3和α5β1整合素结合，与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进卡波氏肉瘤(Kaposis sarcoma,KS)的形成[7，8]；③通过影响神经细胞钙流，诱导巨噬细胞和小胶质细胞表达TGF-β、TNF等神经毒性物质，发挥神经毒作用，促进艾滋病脑病的发生[9,10,11]。　　 Tat碱性氨基酸富集区(49-57aa)是Tat的穿膜和核定位功能基序，是Tat蛋白的主要中和表位之一。其中和抗体可消除Tat分子所特有的穿入其他细胞发挥毒性的核心功能[12]。此外，Tat碱性区序列在各亚型间高度保守，有利于产生交叉反应谱更广的抗体。已有研究表明，构建Tat51位、55位定点突变后，碱性区表位未被破坏，且Tat穿膜活性和胞外活性被大大减弱[13]。因此本研究拟利用噬菌体展示技术分子进化平台，对天然Tat碱性区进行重组改造和筛选，为保证Tat碱性区表位的完整性，我们保留了Tat核心区(38-48aa)，构建由核心碱性区突变片段经随机连接肽相互连接的重复串联的噬菌体展示文库，用含有高中和活性Tat抗体的兔抗血清进行亲和筛选，以期获得一系列碱性区表位构象稳定，而生物活性明显降低的突变体序列，为新型Tat疫苗的研发做基础研究。　　 本研究分以下三部分进行：　　 一、HIV-1 PET32a-Tat38-61蛋白的表达及免疫反应性鉴定　　 功能研究表明：Tat蛋白核心区(38-48aa)可与旁观未感染细胞的微管蛋白结合引发细胞凋亡[14]；Tat蛋白碱性区(49-57aa)介导Tat蛋白穿膜，与Tat细胞外活性密切相关[14,15]。结构研究表明[16]：Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规则卷曲类型的分子，缺乏稳定的二级结构和高级结构，其分子构想极不稳定，出于快速动态的变化之中，导致以Tat作为抗原，刺激效果差，高亲和力的抗体较少且容易被降解。因此，Tat核心碱性区重要表位是否能够得到保留是噬菌体突变文库亲和筛选的基础。为此，我们首先将Tat的核心碱性区38-61aa构建到原核表达载体，纯化出PET32a-Tat38-61蛋白，并通过含有Tat抗体的阳性血清对其进行免疫反应性鉴定。　　 我们成功构建并表达出PET32a-Tat38-61蛋白，并通过ELISA鉴定其免疫反应性，结果显示含Tat抗体的血清与PET32a-Tat3861融合蛋白呈特异性反应，说明PET32a-Tat38-61蛋白碱性区重要表位得到保留，为进一步制备针对核心碱性区的中和抗体以及随机突变文库的亲和筛选奠定基础。　　 二、HIV-1 Tat核心碱性区随机突变组合文库的构建　　 研究表明，碱性区两个重要的位点51K和55R定点突变后，对该表位无破坏，且Tat穿膜活性和胞外活性被大大减弱。因此，为了获得一系列碱性区表位构象稳定，而生物活性明显降低的突变体，我们首先构建了针对Tat碱性区的突变体文库。通过采用含随机核苷酸序列的引物， Overlap PCR方法对碱性区两个位点51K和55R进行了随机突变，使之转变成51X和551X。此外，构建适合的大容量生物大分子变异体文库是进行体外分子进化研究的关键。因此，为了扩大碱性区基因序列中被筛选的范围，同时在碱性区61位后引入6个随机连接肽X6，以期扩大文库的重组子，并利用随机连接肽可与碱性区表位序列之间相互作用，稳定展示表位的构象。　　 我们成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区随机突变组合文库，并且其库容、多样性、随机性均达到文库构建要求，为后续用含有高中和活性的抗Tat兔抗血清进行亲和筛选奠定了基础。　　 三、HIV-1 Tat核心碱性区随机突变组合文库的亲和筛选　　 通过第一部分的鉴定，我们发现碱性区肽段可以较好的保留其中和表位，我们用两种兔抗血清：兔抗PET32a-Tat1-101和兔抗PET32a-Tat38-101，同时对TCBR随机突变组合文库进行亲和筛选，以期获得亲和力更强，穿膜活性更低新型免疫原的代表性序列。通过两种兔抗血清同时对文库进行两轮筛选，每轮结束后，挑取单克隆进行PCR鉴定，并对PCR鉴定过的阳性克隆进行序列分析。　　 两种Tat兔抗血清对TCBR文库两轮筛选后重组子PCR鉴定结果显示：①TCBR文库中突变片段的插入率由70％上升到90％左右，说明与Tat抗体亲和高的突变体片段通过筛选得到有效富集；②包含2个突变片段的重组子在文库中所占的比例显著下降，而包含单个突变片段的重组子在文库中所占的比例由筛选前的55％上升到90％左右。理论上，通过连接肽串联重复多个突变体片段形成的大分子多肽，由于亲和力的关系，抗原表位重复次数多具有选择性优势，容易被进化筛选获得。但两轮筛选后突变体片段结构的变化，似乎说明突变体片段的重要突变位点51位、55位的突变情况较大分子多肽对优势抗原表位的富集具有更重要的作用。　　 两种Tat兔抗血清对TCBR文库每轮筛选后，对40个重组子进行序列测定，结果显示：①51位碱性氨基酸得到富集，这与理论相符，天然Tat51位为赖氨酸(K)；②51位、55位都出现特征性氨基酸脯氨酸(P)。一项日本实验研究结果似乎说明51位突变成P更有利于Tat穿膜[18]，这与本实验的目的截然相反，但出现了相同的特征性氨基酸，这种联系还需要进一步的研究。似乎脯氨酸本身结构更容易稳定表位的空间构象。③51S-55P可作为一个有意义的候选特征序列，进一步研究。另有一项法国实验研究表明，将Tat碱性区的51位赖氨酸(K)定点突变成苏氨酸(T)，55位精氨酸(R)定点突变成亮氨酸(L)，构成突变体“STLA Tat”，其反式激活活性消除，胞外毒性大大降低。根据氨基酸分类，51位T为极性氨基酸，而筛选得到的特征性氨基酸S与也同为极性氨基酸，55位L为疏水性氨基酸，而筛选得到的特征性氨基酸P与也同为疏水性氨基酸，因此，根据筛选所得特征性氨基酸结合已有研究，可将51S-55P作为一个有意义的候选特征序列，做进一步研究。帽综上所述，我们成功用两种兔抗血清对TCBR随机突变文库进行了两轮亲和筛选，并通过对候选重组子序列测定分析，发现突变片段的重要位点51位、55位的出现特征性氨基酸，51X为PS，55X为Y/P，其中，51S-55P可作为一个有意义的可选候选特征序列，进一步研究。　　 本课题构建了pET32a-tat38-61原核表达质粒，纯化并鉴定了PET32a-Tat38-61蛋白的免疫反应性，为后续使用Tat兔抗血清对碱性区突变体文库筛选奠定了基础；成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区随机(TCBR)突变组合文库并通过两种抗Tat兔抗血清PET32a-Tat1-101和PET32a-Tat38-101对文库进行了两轮筛选，结果发现筛选后重组子突变片段的重要位点51位、55位的出现特征性氨基酸，51X为PS，55X为Y/P，其中，51S-55P可作为一个有意义的候选特征序列，进一步研究。本研究尝试应用以噬菌体展示技术为基础的分子进化手段对HIV-1株Tat碱性区进行改造和筛选，以期获得一系列碱性区表位构象稳定，而生物活性明显降低的突变体序列，为新型Tat疫苗的研发做基础研究。