【摘 要】
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目的制备抗DIXDC1的特异性单克隆抗体;鉴定抗DIXDC1抗体的特性;初步观察DIXDC1蛋白在大肠癌及癌旁正常组织的定位表达情况,为以后研究DIXDC1与大肠癌发生的关系提供初步的理
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目的制备抗DIXDC1的特异性单克隆抗体;鉴定抗DIXDC1抗体的特性;初步观察DIXDC1蛋白在大肠癌及癌旁正常组织的定位表达情况,为以后研究DIXDC1与大肠癌发生的关系提供初步的理论依据。方法分别将构建好的含编码DIXDC1蛋白氨基端(N端)和DIXDC1蛋白羧基端(C端)的重组质粒pGEX-GST-DIXDC1-N和pGEX-GST-DIXDC1-C转化BL21(DE3)大肠杆菌后IPTG诱导表达融合蛋白GST-DIXDC1-N和GST-DIXDC1-C;GST亲和层析法分别纯化该两种目的蛋白并各自作为抗原免疫Balb/c雌性小鼠,取效价最高小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western Blot筛选及鉴定分泌抗DIXDC1单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞克隆;最后以免疫组织化学SP两步法,研究DIXDC1蛋白在人类结直肠癌及癌旁正常组织的定位与表达。结果成功地用原核细胞表达并纯化了大量人源性GST-DIXDC1-N和GST-DIXDC1-C融合蛋白;成功筛选出10株分泌特异性抗人DIXDC1单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆,其中8株克隆能用于免疫组化;成功地用所获抗人DIXDC1单克隆抗体检测了DIXDC1蛋白表达产物在结直肠交界性肿瘤组织的分布,结果显示DIXDC1蛋白在结、直肠癌的癌性腺上皮细胞及平滑肌细胞胞浆内过度表达。结论成功地用原核细胞诱导表达并纯化了大量人源性DIXDC1融合蛋白;成功地制备了特异性的抗人DIXDC1单克隆抗体;成功地鉴定了抗体的效价、类型;运用制备的抗体分别能成功地结合DIXDC1蛋白的线性结构和空间结构;成功地检测出DIXDC1蛋白在结直肠癌腺上皮及平滑肌细胞胞浆内高表达。
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