论文部分内容阅读
背景:肌腱和韧带的损伤在肌肉骨骼系统中损伤中占据重要比例,其高发病率,高额医疗费用给病人带来极大痛苦。肌腱解剖结构特殊,其内血管供应少,自身愈合能力差,损伤后愈合时间漫长,而且以瘢痕愈合为主,因此肌腱损伤治疗给临床医生带来了相当大的挑战。肌腱病变主要治疗方法的选择目前有:非手术和手术。前者包括皮质类固醇、非甾体类抗炎药、透明质酸、富含血小板的血浆、超声、体外冲击波疗法等,后者外科手术技术目前亦取得了飞速进步,但是无论选择何种治疗方式,目前均不能达到令人满意的效果。究其根本原因是肌腱细胞增殖能力低,分化程度高,损伤后再难形成。近年来,基于干细胞的组织工程与再生医学研究,已成为医学界的发展热点,在肌腱和韧带的修复与再生领域被广泛提出,并抱以很大期望。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)因其分化水平相对较低且具有多向分化的潜能而在在肌腱与韧带修复与再生领域脱颖而出。有研究证实Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)是调节MSCs向脂肪、骨骼、软骨等分化的重要蛋白。然而目前YAP在MSCs向肌腱分化过程中的作用尚未见报道。目的:探究在小鼠C3H/10T1/2细胞成肌腱分化中骨形态发生蛋白-12(BMP-12)是否起到诱导分化作用以及分化为肌腱细胞的最佳条件;通过干扰Hippo信号通路中的YAP蛋白表达进而探究YAP蛋白对BMP-12诱导MSCs向肌腱分化过程的影响;探讨Hippo信号通路下游的效应因子YAP在干细胞成肌腱分化过程中的作用。方法:1.利用细胞免疫荧光的方法测定C3H/10T 1/2细胞以不同BMP-12诱导浓度梯度及作用时间诱导后肌腱细胞标志蛋白Tenomodulin荧光信号强度,以筛选最佳BMP-12诱导浓度及最佳作用时间。2.细胞C3H/10T1/2经10 ng/ml的BMP-12诱导后,分别用细胞免疫荧光及western-Blot方法探究肌腱细胞标志蛋白Tenascin C(TNC)、Tenomodulin(TNMD)、Scleraxis(SCX)变化。3.细胞免疫荧光方法测定YAP蛋白在BMP-12诱导肌腱分化后荧光信号的变化。4.Western-Blot方法筛选干扰YAP蛋白表达效果最佳的质粒。5.Western-Blot方法及细胞免疫荧光的方法检测干扰YAP表达后对BMP-12诱导C3H/10T1/2分化时对肌腱标志蛋白表达的影响。结果:1.在10 ng/ml的BMP-12诱导后Tenomodulin荧光信号有明显增强;10 ng/ml的BMP-12诱导48 h、72 h后Tenomodulin荧光信号有明显增强。2.细胞免疫荧光显示:细胞C3H/10T1/2经10 ng/ml的BMP-12诱导48 h后细胞免疫荧光信号强度肌腱细胞标志蛋白Scleraxis、Tenascin C、Tenomodulin均有明显增加;Western-Blot结果显示Scleraxis、Tenascin C、Tenomodulin蛋白在诱导48 h后表达量高于正常组(P<0.05)。3..细胞免疫荧光显示:10 ng/ml BMP-12诱导48 h后YAP蛋白信号强度明显增强且向细胞核内转移。4.C3H/10T 1/2经质粒YAP-MUS-1283转染48 h后相对正常组来说YAP蛋白表达量明显下降(P<0.05)。5.质粒YAP-MUS-1283转染后Western-Blot结果显示:经质粒转染方法下调YAP后再用BMP-12诱导C3H/10T1/2细胞48 h,肌腱标志物Scleraxis、Tenascin C及Tenomodulin相对于仅BMP-12诱导48 h呈明显下降趋势(P<0.05)。细胞免疫荧光结果:经质粒转染方法下调YAP之后细胞C3H/10T1/2再被BMP-12诱导48 h,肌腱标志蛋白Scleraxis、Tenascin C及Tenomodulin荧光表达强度相对于仅BMP-12诱导48 h呈明显降低。结论:1.在体外实验中,BMP-12具有明显诱导成肌腱分化的作用且10 ng/ml的BMP-12诱导C3H/10T1/2成肌腱分化48 h效果最佳。2.YAP蛋白在BMP-12诱导C3H/10T1/2分化过程中向核内转移,YAP可能作为肌腱分化相关的转录因子来影响干细胞向腱系分化。3.YAP蛋白在BMP-12诱导MSCs向肌腱分化过程中起调控作用,分化过程中需要YAP的表达。