B7-H4是2003年由多位科学家发现的B7家族的一个成员，属协同刺激分子的一类，在限制、终止和削弱T细胞的免疫应答中提供了重要的负性共刺激信号。在淋巴组织和非淋巴组织中能检测到B7-H4mRNA的广泛表达，但其蛋白却在这些正常组织中检测不到。相反，经研究发现在人类许多恶性肿瘤如卵巢癌、肾癌及胃癌中该分子却呈高表达，研究表明B7-H4在帮助肿瘤细胞逃逸免疫应答过程中起到了非常重要的作用。由于研究者一开始就发现B7-H4分子含有信号肽，并可与活化T细胞表面受体结合抑制T细胞增殖，因此B7-H4分子一开始就被定位为膜蛋白。但是之后有研究发现在许多肿瘤细胞内B7-H4不表达于细胞膜而表达于细胞内。而我们在研究中发现人B7-H4含有核定位序列，推测该分子可能是一双定位蛋白。为研究核定位序列对B7-H4功能的影响，本文构建了B7-H4野生型与核定位序列突变体转基因细胞进行研究，本研究为负型共刺激分子功能的研究提供了新思路。本论文主要包括以下三部分内容：一、B7-H4在肿瘤细胞中的亚定位在SK-BR-3，MDA-MB-453，MCF-7，U937和THP-1细胞株中加入核输出抑制剂LMB，使B7-H4分子在细胞核中堆积，通过激光共聚焦显微镜观察B7-H4分子在细胞中的亚定位。实验结果发现在LMB的作用下B7-H4可聚集在细胞核，说明人B7-H4分子可转移到细胞核，这一结果说明B7-H4分子不仅仅是一单纯的膜蛋白，还可以转移到细胞核。二、人B7-H4野生型基因的克隆及突变体基因的构建我们用软件分析人B7-H4的基因序列，发现其中有一段核定位信号序列（NLS）-KRRSH，而鼠源性的B7-H4则无。且在鼠源性B7-H4中与KRRSH所对应的序列为KRRSQ。我们通过RT-PCR法克隆出野生型B7-H4基因，然后应用定点突变法获得无NLS的B7-H4突变体基因，经测序确认后再将野生型及突变体基因分别与真核质粒pIRES2-EGFP连接，并经双酶切与测序确认。三、人B7-H4野生型基因及突变体基因转染细胞的构建及细胞毒分析和促细胞增殖的研究将上述实验获得的野生型B7-H4基因（B7-H4-WT）、突变体B7-H4基因（B7-H4-MT）和真核质粒pIRES2-EGFP基因用脂质体共转法分别转染进入肾细胞癌786-O中，然后进行细胞毒分析。发现在抗肿瘤药物（五氟尿嘧啶、长春新碱、阿霉素）的作用下三组转基因细胞株中B7-H4-WT细胞组的抵抗细胞毒性的能力最强，其次为突变组，Mock组的最弱。然后研究这些细胞株的增殖率。在实验过程中我们分别测定0h、24h、48h、72h和96h的细胞数目来研究其增殖率，发现B7-H4-WT转基因细胞组的增殖率最高，其次为突变体组与MOCK组，两者相差不多。以上结果说明B7-H4促进细胞增殖及赋予细胞抗凋亡作用与其核转移功能密切相关。本研究首先分析了B7-H4分子在肿瘤细胞中的亚定位，从实验结果推断其能在细胞核和细胞质间转移，并存在一核定位序列。我们分析其序列确认了NLS的存在。然后通过构建B7-H4野生型、突变体及阴性对照组的转基因细胞来进行初步的体外研究，验证B7-H4可转移到细胞核并促进肿瘤细胞的增殖，本项研究为以后的负性共刺激分子的功能研究开创了新的研究思路，为肾癌的临床治疗提供理论依据与实践探索。