论文部分内容阅读
背景:心血管疾病是我国乃至全世界最常见的疾病之一,心力衰竭是最常见的致死因素。心肌细胞凋亡可使心功能逐渐下降最终导致心力衰竭,因此抑制心肌细胞凋亡是延缓心功能不全发生和治疗心力衰竭的重要环节。近年来,人们在心衰患者血清中检测到高水平的血管紧张素II 1型受体的自身抗体（angiotensin II type 1receptor autoantibody,AT1-AA）,提示其可能参与心力衰竭进程,但该自身抗体是否可以诱导心肌细胞凋亡引起心功能不全及其具体机制尚不清楚。自噬通常被认为是细胞的一种正常保护机制,是维持细胞稳态所必需的。正常的情况下,它通过溶解部分细胞器,对某些疾病起保护作用。然而,过多的和不受控制的自噬激活会导致细胞凋亡。有研究表明,血管紧张素II（angiotension II,Ang II）可以诱导自噬,那么具有类血管紧张素II作用的AT1-AA是否也会对心肌细胞的自噬产生影响?研究发现,内质网应激与自噬有密切关系,自噬水平的改变可以影响内质网应激,那么AT1-AA是否会诱导内质网应激?内质网应激在自噬和凋亡之间是否发挥作用,以及发挥什么样的作用尚不清楚。因此,本研究设想AT1-AA通过AT1受体,上调自噬诱导大鼠心肌细胞凋亡,引起心功能不全,参与心力衰竭的进程。目的:建立AT1-AA主动免疫大鼠模型,观察AT1-AA对心脏组织细胞自噬、内质网应激和凋亡的影响,并探究其引起心功能不全的作用机制,为心力衰竭的临床治疗提供干预靶点及治疗策略。方法:1.PCR鉴定大鼠基因型:AT1a受体基因敲除SD大鼠（杂合子）合笼,得到8周龄雄性大鼠,通过PCR鉴定大鼠基因型。2.AT1R-ECⅡ肽段主动免疫建立大鼠模型:基因鉴定后分组,将SD大鼠分为Vehicle对照组、AT1-AA免疫组和AT1-AA+3MA组;将AT1a受体敲除鼠（纯合子）设为AT1a R-/-+AT1-AA组,每组n=6。主动免疫大鼠,后三组首次免疫时将AT1R-ECⅡ肽段溶于Na2CO3溶液,再与弗氏完全佐剂混匀。两周后加强免疫,不完全弗氏佐剂代替完全佐剂,2W/次,共12W。Vehicle对照组免疫时将抗原溶液换为等量Na2CO3溶液,其余同AT1-AA免疫组。AT1-AA+3MA组,免疫8周时腹腔注射3-MA,隔天一次,共4周。3.ELISA检测AT1-AA组大鼠AT1-AA血清滴度。每次免疫前均静脉采血,留取血清。4.小动物超声检测各组大鼠心脏功能和结构变化。5.HE染色观察心脏结构变化。6.TUNEL染色检测心脏组织细胞凋亡情况。7.Western blot检测凋亡、内质网应激和自噬相关蛋白表达。结果:1.PCR鉴定大鼠基因型根据PCR鉴定结果分为SD大鼠（阴性纯合子）,AT1a受体敲除鼠（阳性纯合子）和AT1a受体敲除鼠（杂合子）。2.AT1-AA阳性大鼠模型的建立ELISA显示,AT1-AA组与Vehicle组相比,免疫第2周血清AT1-AA含量上升（P<0.05）。随免疫进程增加,血清中AT1-AA含量呈上升趋势,免疫8周时达到峰值,直到实验结束一直维持在高水平（P<0.01）。3.AT1-AA导致大鼠心功能下降及心脏结构改变心脏超声测得,与Vehicle组相比,AT1-AA组大鼠在免疫12周时的LVIDs和LVESV均显著增加（均P<0.05）,LVEF和LVFS均明显下降（均P<0.05）。HE染色表明,与Vehicle对照组相比,AT1-AA免疫组大鼠在免疫12周时心肌细胞排列紊乱,细胞核大小明显不同,细胞质空泡化,横纹模糊,细胞间隙扭曲增宽,心肌纤维走向紊乱且破裂。4.AT1-AA诱导心脏组织细胞凋亡增加免疫12周时,免疫组比Vehicle组大鼠TUNEL染色棕黄色细胞核增多,细胞凋亡指数增加（P<0.05）。Western blot表明,与Vehicle对照组相比,AT1-AA组在免疫12周时心脏组织的cleaved caspase-3/caspase-3比值增加（P<0.05）。5.AT1-AA上调心脏组织自噬表达Western blot结果显示,与Vehicl组相比,AT1-AA组在免疫12周时心肌组织LC3 II/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白表达增加（P<0.05）,但p62蛋白的水平降低（P<0.05）。6.AT1-AA激活心脏组织内质网应激Western blot结果显示与Vehicle对照组相比,AT1-AA免疫组在免疫12周时,心脏组织GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白的水平增加（均P<0.05）。7.自噬抑制剂3-MA减轻AT1-AA诱导的大鼠心脏组织自噬和凋亡,抑制内质网应激,改善心功能不全腹腔注射3-MA 4周后,结果显示,与AT1-AA免疫组相比,AT1-AA+3MA组大鼠的LC3 II/LC3 I、Beclin1、cleaved caspase-3/caspase-3、CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白的水平均降低（均P<0.05）,而p62蛋白的水平升高（P<0.05）。心脏组织棕黄色颗粒较少,心肌细胞凋亡指数降低（P<0.05）。LVIDs和LVESV均下降（P<0.05）,LVEF和LVFS均显著增加（P<0.05）;心肌细胞排列紊乱减少,横纹较清晰,细胞间隙扭曲增宽程度降低,心肌纤维走向紊乱且破裂程度减轻,心肌细胞溶解减少。8.AT1a受体敲除降低AT1-AA诱导的心脏组织自噬、内质网应激和凋亡水平,改善心功能不全AT1a受体敲除鼠主动免疫12周时,实验发现,与AT1-AA免疫组相比,AT1a R-/-+AT1-AA组大鼠的LC3 II/LC3 I、Beclin1、cleaved caspase-3/caspase-3、CHOP、GRP78和Caspase-12蛋白的水平均降低（均P<0.05）,p62蛋白的水平则升高（P<0.05）。心脏组织棕黄色颗粒减少。LVIDs和LVESV均下降（均P<0.05）,LVEF和LVFS均显著增加（均P<0.05）;心肌细胞排列紊乱减轻,横纹较清晰,细胞间隙扭曲增宽程度降低,心肌纤维走向紊乱且破裂程度减轻。结论:AT1-AA作用于AT1a受体,上调大鼠心脏组织自噬,激活内质网应激,诱导在体大鼠心肌细胞凋亡,进而引起心功能不全,参与心力衰竭的进程。