CRISPR/Cas9系统是近年来出现的一项新的生物技术,能够利用RNA介导基因编辑实现基因组的定向修饰,被逐渐应用于多种植物的基因组编辑研究,但迄今尚未在柿属植物中见到相关报道。柿果肉中原花青素的积累是其产生涩感的主要因素,原花青素的合成需要多种结构基因和调控基因协同完成,其中结构基因ANR通过将花青素转变为原花青素前体物质—表儿茶素,发挥了关键作用;类胡萝卜素是参与柿果及叶片等组织器官成色的重要色素,PDS基因在其生物合成过程中起关键作用,能够催化无色的八氢番茄红素转换为有色的类胡萝卜素。本研究利用CRISPR/Cas9技术分别对烟草Nt PDS基因和君迁子Dl ANR基因、Dl PDS基因进行定向敲除,首先通过已有报道构建含有两个靶点的双元表达载体,进而利用遗传转化实现内源基因的稳定变异,最终通过表型观察及测序检测编辑效果;进一步将建立的技术体系应用于柿属植物。主要研究结果如下:1.选用植物的基因编辑载体PHSE401-GFP和PRGEB32-Gh6.7S-Cas9,针对栽培型烟草的Nt PDS基因构建PHSE-2g R-Nt PDS、p RGEB-2g R-Nt PDS重组载体,经叶盘法转化并诱导再生,扩增抗性植株靶位点附近200-300 bp片段,测序检测到两株转p RGEB-2g R-Nt PDS载体的再生苗的靶基因发生改变,并观察到阳性植株产生明显的白化表型。2.利用上述基因编辑载体PHSE401-GFP和PRGEB32-Gh6.7S-Cas9,成功构建君迁子靶基因敲除载体:PHSE-2g R-Dl ANR、PHSE-2g R-Dl PDS、p RGEB-2g R-Dl ANR、p RGEB-2g R-Dl PDS,采用改进的叶盘法转化君迁子组培苗并筛选培养;对转入PHSE401-GFP载体的再生愈伤组织进行荧光显微镜观察,检测到荧光信号并通过PCR扩出PRGEB32-Gh6.7S-Cas9载体中Cas9蛋白片段,但未检测到靶点修饰。综上所述,本研究利用一个融合载体同时表达Cas9蛋白和多个sg RNA的方法,建立了基于CRISPR/Cas9系统定向敲除烟草内源基因的技术体系,并实现了CRISPR/Cas9技术在君迁子上的应用,研究结果可为柿属植物相关功能基因编辑奠定基础。