抑郁症是一种常见的精神疾病,严重者可导致残疾或者自杀。目前,抑郁症的发病机制尚不明确,存在多种假说。现有的抗抑郁药物靶点单一,长期服用存在明显的不良反应。因此,寻找作用于多靶点且更安全有效的抗抑郁药物至关重要。中医药具有多靶点、多途径和整体性的特点,是抗抑郁药物研发的重要来源之一。人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种珍贵的传统中药材,具有大补元气、安神益智的功效,可用于治疗失眠惊悸、情绪障碍等症。人参皂苷是人参的主要活性成分,:包括原人参二醇(PPD),原人参三醇(PPT)和齐墩果酸三种类型。人参皂苷Rb1(Rb1)和人参皂苷Rg1(Rg1)分别是PPD和PPT的代表成分。PPD型人参皂苷相对于PPT型人参皂苷,在血浆中具有更高的浓度和半衰期。代表性成分人参皂苷Rb1具有抗炎、神经保护、防治心脑血管疾病等多种药理活性,同时也是在脑中分布较高的主要成分之一。人参总皂苷、人参皂苷单体Rb1,Rg1和Rg3等均表现出较好的抗抑郁活性。人参皂苷口服具有生物利用度差和脑中分布不均的特点,如人参皂苷Rb1 口服利用度仅为1%左右,但Rb1去糖基化体内代谢物Rg3,C-K,Rh2和PPD等具有更高渗透性和生物利用度,同时也具有抗抑郁活性。Rb1在慢性不可预知温和应激模型中表现出抗抑郁作用,主要机理是上调单胺神经递质,调节BDNF及其下游蛋白TrkB,影响促肾上腺皮质激素和皮质醇等水平。由于神经炎症是抑郁症的主要机制之一,Rb1对脂多糖神经炎症模型引起的急性抑郁的作用和分子机制尚无报道。网络药理学能整体分析中药复方和中药成分的作用机制,独立呈现某种特定疾病相关的“成分-靶标-通路”有效揭示中药药效物质基础及其分子机制,为实验验证提供理论依据。本研究采用UPLC-QTOF-MS对人参皂苷Rb1体内代谢成分进行分析鉴定,通过网络药理学方法对人参皂苷Rb1和代谢成分的抗抑郁作用机制进行分析预测,并进行实验验证。理论预测和验证实验发现了 Rb1抗抑郁的作用靶点GR,p38 MAPK和NF-κB p65,以及神经活性配体-受体的相互作用、MAPK及NF-κB信号通路的潜在作用机制;首次发现了 Rb1体内代谢成分人参皂苷F2具有比Rb1更强的抗炎活性以及相似的抗抑郁样活性;发现人参皂苷Rd的抗炎和抗抑郁活性均与Rb1相似。F2和Rd分别为Rb1脱去两分子和一分子葡萄糖的皂苷。虽然两者也存在于人参原生苷中,但含量相对较少。本发现丰富了 Rb1抗抑郁药效物质及潜在作用的相关靶点和可能的作用通路。本实验结合网络药理学和药效验证,研究Rb1及体内代谢物的抗抑郁活性和作用靶点通路,探讨人参皂苷Rb1抗抑郁药效物质和作用机理。(1)采用脂多糖诱导的小鼠抑郁模型,通过对比强迫游泳和悬尾实验中测定的不动时间,检测Rb1的抗抑郁样作用。结果表明,Rb1呈剂量依赖地改善了由脂多糖引起的不动时间的延长,表现出抗抑郁样行为。(2)采用UPLC-QTOF-MS,建立Rb1及其代谢产物的定性分析方法,分析正常及抑郁模型小鼠体内的代谢产物。结果表明,正常及模型小鼠体内Rb1的代谢产物种类相同。吸收入血、脑和空肠组织中的成分均为Rb1,Rd和PPD。尿液和粪便中的代谢产物均为Rb1,Rd,Rh2,Rg3,F2和C-K。Rb1在血浆和脑中代谢途径主要是通过脱去一分子葡萄糖生成Rd,继而失去3分子葡萄糖生成皂苷元PPD。Rb1在尿液和粪便中代谢途径主要是脱去一分子葡萄糖生成Rd,继而失去不同位置的一分子葡萄糖生成Rd和Rh2,进一步失去一分子葡萄糖生成F2和C-K。去糖基化是Rb1在小鼠体内的主要代谢途径。(3)通过网络药理学对Rb1及其代谢物抗抑郁靶点进行预测。采用网络药理学方法构建“成分-靶标-疾病”,并通过PPI互作蛋白分析,GO功能富集分析,KEGG通路分析,进行机制预测。发现91个关键靶点,20个主要的生物富集功能和通路。神经活性配体-受体相互作用是分析得到的最相关的信号通路。此外,MAPK和NF-κB炎症信号通路频繁出现在其他主要通路中。关键靶点GR和5-HT1A是神经活性配体-受体相互作用中的重要靶标;MAPK14是MAPK通路中的重要靶标。网络药理学结果表明神经活性配体-受体相互作用及炎症反应相关通路可能为Rb1及其代谢物发挥抗抑郁作用的主要机制。(4)进行靶点-通路验证实验。采用酶联免疫法(ELISA)测定血清中的炎症因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),发现Rb1明显降低了两者因脂多糖导致的水平增高,发挥抗炎作用;采用HPLC-MS测定小鼠海马组织中的五羟色胺(5-HT),色氨酸(TRP),犬尿氨酸(KTN),γ-氨基丁酸(GABA),谷氨酸(Glu)和谷氨酰胺(Gln),发现Rb1可以调节5-HT,TRP,KYN,GABA的含量,但是Glu和Gln的作用趋势与文献不符;采用qPCR技术探究Rb1对小鼠海马组织中5-HT1A和Nr3c1的mRNA水平的表达,采用Western Blotting探究Rb1对5-HT1A蛋白水平的表达。结果表明,Rb1可明显增强5-HT1A的mRNA及蛋白水平的表达,增加Nr3c1的mRNA水平的表达,表明Rb1对神经活性配体-受体相互作用通路具有调节作用。采用qPCR技术探究Rb1对小鼠海马组织中MAPK14和NF-κB p65的mRNA水平的表达,采用Western Blotting探究Rb1对NF-κB p65蛋白磷酸化水平的影响。结果发现,Rb1可明显降低p38 MAPK和NF-κB p65的mRNA水平的表达,降低NF-κB的磷酸化水平,表明Rb1对MAPK和NF-κB信号通路的激活具有抑制作用。同时,也验证了网络药理学中的Rb1影响神经炎症和神经活性配体-受体相互作用的预测。(5)Rb1代谢产物Rd和F2首次发现具有抗抑郁活性。本研究采用脂多糖抑郁小鼠模型,对给与Rd和F2的小鼠进行行为学测定。结果发现Rd和F2具有明显的抗抑郁样作用;可降低血清中炎症因子白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,且F2高剂量组表现出较Rb1更为明显的抗炎作用。小结:本研究在明确Rb1在LPS诱导的抑郁小鼠模型上具有明显抗抑郁作用的基础上,建立了 Rb1在小鼠体内代谢产物的UPLC-QTOF-MS鉴定方法,通过网络药理学方法预测Rb1及其代谢产物抗抑郁作用的“成分-靶标-疾病”,并用体内实验进行验证。结果表明,Rb1可以剂量依赖性地增加5-HT的含量以及5-HT1A受体的mRNA和蛋白表达;增加GR的基因表达,调节色氨酸代谢。同时,Rb1降低LPS诱导的促炎细胞因子和IDO活性的增加,可能通过抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化而影响MAPK和NF-κB通路。该结果验证了网络药理学的预测,并表明神经活性配体-受体相互作用途径可能与Rb1的抗抑郁作用有关。在网络药理学指导下,首次发现并验证Rb1代谢产物Rd和F2具有抗抑郁作用,先前研究中尚未报道,并且F2在抗炎方面优于Rb1。本研究首次揭示了 Rb1可能参与神经活性配体-受体的相互作用途径以及相关靶点GR和5HT1A的潜在调控,并进行了实验验证,发现Rb1及其代谢产物抗抑郁的多靶点,多途径作用机制。为进一步明确Rb1药效物质基础和药理机制提供了参考,也为Rd和F2成为潜在抗抑郁药提供了理论基础。创新性:本论文研究Rb1对脂多糖神经炎症模型引起的急性抑郁的作用和分子机制,发现了 Rb1可以调节神经活性配体-受体相互作用中的GR的作用靶点,通过抑制p38 MAPK和NF-κB p65的磷酸化影响MAPK和NF-κB通路,同时说明了 Rb1代谢物与抗抑郁药效的相关性。首次发现了人参成分Rd和F2的抗抑郁活性,丰富了人参抗抑郁的物质基础。