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干扰素a-2b是一种具有广谱抗病毒活性和免疫调节作用的多肽物质,临床应用广泛,但其体内半衰期短,需要长期频繁给药,为了降低病人多次给药痛苦,增加依从性,降低用药成本,提高病人生活质量,我们采用聚乙二醇化干扰素a-2b的方法对其改性研究,而市场上长效聚乙二醇化的干扰素产品质量均一性差,都是随机修饰混合物,存在活性丢失不确定性的缺点,本实验采用mPEG-ALD衍生物选择性修饰干扰素a-2b氮端氨基的方法,制备定点单修饰物。mPEG-ALD衍生物对氮端氨基的选择性,主要根据不同氨基解离常数差异的性质(a氨基pKa7.8、e氨基pKa10.1),通过选择优化反应条件,达到高比例的氮端单修饰物,然后通过两步离子交换层析方法,先用阳离子交换层析粗分离制备PEG单修饰物,然后再使用高效阳离子交换层析预装柱精分离制备高纯度的氮端定点单修饰物。本实验还建立了分析不同修饰位点异构体的IEC-HPLC方法,考察氮端单修饰产物的均一性；用trypsin蛋白酶消化单修饰物异构体和原蛋白,做肽谱图比较,用MALDI-TOF-MS分析分子量,确定蛋白修饰位点。第一步粗分离制备,使用GE公司专门用于纯化PEG修饰物的Micro cap SP填料,根据样品处理量自装柱,采用盐离子梯度洗脱,本步可得单修饰物SEC纯度为100%,且收率达到85%；第二步精分离制备,选用TOSOH公司的TSK-Gel SP-5PW (13um1000A2.1cm*15cm)离子交换柱,采用盐离子梯度和pH梯度综合洗脱,此步收率为75%。单修饰物异构体的IEC分析方法选用TOSOH公司的TSK-Gel SP-5PW柱(10um1000A7.5mm*7.5cm),其他洗脱条件同异构体精分离制备方法,本IEC分析方法可分离出6个以上不同修饰位点的单修饰物异构体。经过单修饰物和原蛋白质干扰素的肽谱图分析,并做MALDI-TOF质量分析后,确定各单修饰物的PEG修饰位点。