目的:妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期最常见的糖代谢异常类型,占妊娠高血糖的80-90%,显著增加孕妇及其子代近期和远期不良结局。其致病机制与2型糖尿病类似,即胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)和胰岛β细胞功能减退。机体内胰岛素主要通过靶器官发挥生物学作用,其中肝脏是最主要的靶器官之一。肝脏胰岛素抵抗主要表现为胰岛素抑制肝脏葡萄糖输出的能力下降,导致肝糖输出增多,血糖升高;同时IR还影响脂代谢,引起脂质代谢产物的堆积,降低胰岛素敏感性,进一步加重IR,主要的病理特征是肝脏胰岛素信号通路异常,糖异生和糖原分解增加。近年来的研究发现非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在转录和转录后都具有一系列重要的调节潜能。其中,微小RNA(microRNA,mi RNA)是一类长度在19-24个核苷酸之间的ncRNA,通过与靶基因的3’非翻译区结合来影响mRNA的降解和翻译抑制。现阶段越来越多的证据表明,miRNA参与多种病理生理过程,且其异常表达与人类疾病密切相关。Smad家族是细胞内重要的信号转导因子,其中Smad家庭成员3(Smad family member,Smad3)是受体调控型Smad,Smad家庭成员7(Smad family member,Smad7)是抑制型Smad,Smad7抑制Smad3发挥负性调控因子作用。研究发现Smad参与脂肪生成,脂质积累,脂肪酸β氧化,肝糖异生和胰腺β细胞功能等代谢途径。作为妊娠过程中形成的暂时性器官,胎盘不仅是唯一连接母胎的界面,参与母胎间营养物质转运、气体交换和血液循环等过程,还具有重要的内分泌功能,分泌的胎盘源性激素是拮抗胰岛素的主要激素,增加IR,进而导致GDM发生。因此,本研究旨在筛选出GDM胎盘组织中差异表达的非编码RNA,并详细探讨筛选出的差异表达miR-889-3p在GDM中发挥作用的分子机制。研究方法:1、通过高通量测序技术分析6例胎盘组织(正常健康孕妇和GDM孕妇各3例)的全转录组表达谱,筛选出差异表达的ncRNAs,并通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)在一组独立的40例胎盘组织(正常健康孕妇和GDM孕妇各20例)上进一步验证这些差异表达ncRNAs的表达。基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析基因的功能注释和相关的生物学途径,构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络预测各种RNA之间的功能和相互作用。2、高脂饮食喂养8周龄C57BL/6J雌性小鼠建立GDM孕鼠模型,孕期行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT),并计算曲线下面积和糖代谢相关指标。检测高通量测序中筛选出的差异表达miR-889-3p的表达。完成HE染色和油红O染色,测定肝脏组织甘油三酯(TG)含量和糖原含量,检测糖异生关键酶基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-Pase)的mRNA相对表达量及胰岛素信号通路关键因子胰岛素受体底物-2(insulin receptor substrate-2,IRS-2)、磷酯酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的表达。3、利用生物信息学软件预测miR-889-3p和Smad7的结合位点,并应用荧光素酶报告基因进行验证;应用qRTPCR和Western Blot方法检测肝脏组织Smad7,Smad3,叉头状转录因子O1(forkhead box O1,FoxO1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)的表达;应用棕榈酸(PA)干预人正常肝细胞L02建立胰岛素抵抗细胞模型,转染miR-889-3p模拟物、抑制剂和阴性对照,测定培养基葡萄糖剩余含量,并分别检测糖异生关键酶基因,胰岛素信号通路关键因子及Smad7,Smad3,FoxO1和PGC-1α的表达;应用Smad7激动剂干预转染的胰岛素抵抗细胞模型,进一步明确miR-889-3p调控肝脏胰岛素敏感性和糖代谢的分子机制。结果:1、高通量测序共识别出2,817个miRNAs,23,339个lncRNAs和9,513个circRNAs。与正常健康孕妇相比,GDM共筛选出290个差异表达的ncRNAs,包括4个miRNAs,172个lncRNAs和114个circRNAs。2个miRNAs,86个lncRNAs和55个circRNAs在GDM中上调表达,而2个miRNAs,86个lncRNAs和59个circRNAs在GDM中下调表达。选择其中一些差异表达的ncRNAs行qRT-PCR测定其相对表达水平,发现所选ncRNAs的表达与测序结果一致。GO和KEGG途径分析表明,这些ncRNAs的主要靶点与胰岛素抵抗和异常的糖脂代谢相关。2、孕鼠在妊娠第0.5天(GD0.5)血糖正常,GD11.5和GD16.5血糖逐渐升高,GD16.5较GD11.5孕鼠胰岛素抵抗更重,且体重随着孕期进展逐渐增加,表明GDM孕鼠模型建立成功。miR-889-3p在GDM孕鼠胎盘和肝脏组织中的表达均明显高于control组(P<0.05)。肝脏组织形态学结果显示GDM孕鼠肝脏组织出现脂肪变性和脂滴浸润;与control组相比,肝脏TG含量明显升高,糖原含量降低,糖异生关键酶基因PEPCK和G-6-Pase的表达明显增加(P<0.05),胰岛素信号通路关键因子IRS-2,PI3K,Akt和GSK-3β的表达明显下降(P<0.05)。3、荧光素酶报告基因证实Smad7是miR-889-3p的靶基因。与control组相比,GDM组肝脏Smad7的表达下降,而FoxO1和PGC-1α的表达增加,Smad3磷酸化水平升高(P<0.05)。应用PA干预L02细胞成功建立IR细胞模型并进行细胞转染后,检测到PA+miR-889-3p模拟物组(PA+miR-minic组)培养基中葡萄糖剩余量较PA组和PA+miR-889-3p抑制剂组(PA+miR-inhibitor组)明显增加(P<0.05);与PA组和PA+mi R-inhibitor组相比,PA+miR-minic组PEPCK和G-6-Pase的mRNA相对表达量明显增加(P<0.05);胰岛素信号关键因子IRS-2,PI3K,Akt和GSK-3β的表达明显下降(P<0.05);Smad7的蛋白表达下降,而pSmad3,FoxO1和PGC-1α的表达增加(P<0.05)。应用Smad7激动剂干预后,miR-889-3p对糖异生途径和胰岛素信号通路的作用减弱。结论:1、非编码RNA在GDM胎盘中异常表达,可能成为GDM潜在的候选生物标志物。2、miR-889-3p靶向Smad7通过Smad3-FoxO1途径调控肝糖异生途径和胰岛素信号传导,引起肝脏糖脂代谢异常,加重胰岛素抵抗,在GDM中发挥作用。