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研究背景脉络膜新生血管(CNV)发生于多种眼部疾病,如年龄相关性黄斑变性(AMD)、眼组织胞浆菌病(OHS)、病理性近视和眼外伤等。CNV常累及黄斑,可因反复渗出、出血及瘢痕形成导致中心视力丧失,是主要致盲原因之一。当前眼科界关于CNV生成机制的研究已成为热点,以期寻找能够有效防治CNV的途径。CNV的病因尚未阐明,缺血缺氧可能是CNV形成重要的始动因素。局部微环境的改变可致脉络膜毛细血管闭塞、萎缩以及纤维化等引起脉络膜供血不足,因而视网膜缺血缺氧,刺激视网膜色素上皮(RPE)细胞分裂和增生,并分泌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等多种细胞因子,导致脉络膜毛细血管向外层视网膜代偿性生长,最后形成CNV。VEGF是迄今为止发现的作用最强的促血管形成因子,也是重要的促细胞分裂素,缺氧可上调其表达。RPE细胞是CNV中主要的细胞成分,缺氧诱导RPE细胞表达VEGF可能是CNV发生的关键环节。VEGF受多种刺激因素的影响,牵涉的分子生物学机制十分复杂,这使得以抑制VEGF为目的的治疗手段受到很大挑战。虽然VEGF的诱导因素众多,但研究表明缺氧诱导因子1 (HIF-1)和信号转导与转录激活因子3(STAT3)是细胞内两种关键性转录激活因子,可作用于VEGF启动子,直接调控VEGF的表达。HIF-1是缺氧反应中一个重要的调节因子,通过与基因启动子、增强子或其他调控区内的HIF-1特异组合序列结合,参与缺氧诱导VEGF等基因的表达,在血管形成过程中发挥重要作用。STATs是一类通过酪氨酸磷酸化激活的具有SH2同源结构域的转录因子家族,多种细胞因子和生长因子等多肽类配体可参与其激活。实验表明,STAT3参与了细胞对缺氧的应答,缺氧2h时即观察到肺动脉平滑肌细胞内磷酸化STAT3蛋白表达显著升高。近期研究发现,STAT3的异常活化在诱导肿瘤新生血管的形成中具有重要作用。缺氧可激活人肾癌细胞JAK2/STAT3信号转导通路,并通过活化HIF-1α蛋白协同调控VEGF表达,促进血管发生。目的(1)观察激光诱导的大鼠CNV形成早期磷酸化STAT3的定位; (2)建立体外培养的人RPE细胞物理缺氧模型,观察缺氧状态下RPE细胞STAT3的活性变化;(3)运用JAK2激酶抑制剂AG490研究JAK2/STAT3信号转导通路对缺氧诱导的体外培养的人RPE细胞增生以及HIF-1α活化和VEGF表达的影响。方法(1)建立激光诱导的BN大鼠CNV模型,以免疫荧光法观察CNV生成早期磷酸化STAT3的定位;(2)将培养的人RPE细胞置于含体积分数为1%O2、5%CO2和94%N2的培养箱内建立缺氧模型,分别培养1、3、6、12和24h。采用RT-PCR和Western blot方法观察STAT3及其磷酸化表达水平的变化,免疫荧光法观察RPE细胞内STAT3定位的改变;(3)用30μM JAK2激酶抑制剂AG490处理RPE细胞,在缺氧条件下分别培养1、3、6、12和24h,用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测JAK2/STAT3信号通路阻断前后缺氧RPE细胞的增生指数,以RT-PCR和Western blot方法观察HIF-1αmRNA和蛋白的表达,RT-PCR观察VEGF mRNA表达,ELISA检测人RPE细胞上清中VEGF的含量。结果(1)在激光诱导的大鼠CNV生成第3d,即可见磷酸化STAT3高表达于CNV区域,且主要定位于参与CNV生成的增生移行的RPE细胞中;(2) RT-PCR和Western blot显示,正常培养的人RPE细胞内STAT3 mRNA和蛋白表达量微弱。随缺氧时间的延长,STAT3表达量逐渐增强,至12h达到峰值,24h开始下降,但仍高于常氧状态;免疫荧光显微镜观察,常氧状态下,STAT3蛋白荧光主要分布于RPE细胞胞质内。缺氧后,细胞质内绿色荧光强度减弱,细胞核荧光强度明显增强;(3) FCM检测AG490处理组细胞增生指数明显低于对照组(P<0.05);随缺氧时间的增加,RT-PCR显示HIF-1αmRNA和VEGF mRNA表达逐渐增强,至6h达峰值;Western blot检测缺氧后HIF-1α逐渐被活化,至12h达到峰值,24h开始下降;AG490处理组较对照组中HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达以及HIF-1α蛋白的活化均受到明显抑制;ELISA证实,缺氧条件下培养的人RPE细胞上清液中VEGF含量随时间逐渐增加,而AG490处理组RPE细胞条件培养液中VEGF含量显著低于对照组(P<0.05)。结论(1) RPE细胞内STAT3的磷酸化可能参与了激光诱导的大鼠CNV早期的发生过程;(2)缺氧可活化人PRE细胞内STAT3;(3)缺氧诱导的人RPE细胞高表达VEGF,可能部分是通过JAK2/STAT3信号转导通路实现的。