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目的:1.讨论黄芩素(Baicalein,BAI)对胶质瘤U251细胞的自噬及在自噬过程中细胞凋亡的情况。2.探讨BAI激活U251细胞自噬的相关通路。方法:1.将Ad-m Cherry-GFP-LC3B腺病毒转染入U251细胞中,观察BAI在不同作用时间条件下,LC3蛋白的表达情况2.Western blot检测不同浓度(0、10、20、40、80μmol/L)BAI对胶质瘤细胞U251作用24 h后LC3、p-AMPK和cleaved caspase-3蛋白的表达情况。3.Western blot检测BAI(80μmol/L)在不同作用时间(0、6、12、24、36、48 h)条件下LC3、p-AMPK和cleaved caspase-3蛋白的表达情况。4.Western blot检测BAI(80μmol/L)单独和联合抑制剂CQ后LC3蛋白的表达情况。5.免疫荧光检测BAI(80μmol/L)在不同作用时间(0、6、24、36 h)后,细胞中LC3蛋白的变化。6.免疫荧光检测BAI(80μmol/L)联合抑制剂CQ条件下,细胞中LC3蛋白的变化。7.BAI(80μmol/L)在不同作用时间(0、24、36、48 h)条件下,DAPI染色观察胶质瘤细胞U251细胞核的碎裂情况和JC-1染色观察细胞中线粒体膜电位的变化。8.BAI(80μmol/L)单独和联合抑制剂compound C后光镜下观察胶质瘤细胞的生长状况,DAPI染色观察细胞核的碎裂情况和JC-1染色观察细胞中线粒体膜电位的变化。9.Western blot检测BAI(80μmol/L)单独和联合抑制剂compound C后LC3、p-AMPK和cleaved caspase-3蛋白的表达情况。10.CCK-8法检测不同浓度的BAI(20、40、80、100、160μmol/L)、不同浓度的替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)(100、200、300、400、500μmol/L)在不同作用时间条件下,对U251细胞细胞活力的影响。11.CCK-8法检测BAI(100μmol/L)联合不同浓度的TMZ(100、200、300、400、500μmol/L)在不同作用时间条件下,对U251细胞细胞活力的影响。结果:1.将Ad-m Cherry-GFP-LC3B腺病毒转染入U251细胞中,随着BAI药物作用时间的增加,Ad-m Cherry-GFP-LC3B呈现弥散的黄色荧光——斑点状的黄色荧光——斑点状的红色荧光,表明了BAI作用后LC3蛋白的变化过程。2.Western blot显示LC3蛋白的表达随着BAI浓度和处理时间的增加逐渐增加;加入CQ后LC3蛋白的表达增加;免疫荧光检测LC3蛋白,验证了这个结果。3.DAPI染色观察发现24 h时细胞核发生碎裂,随着时间的增加碎裂情况加剧;JC-1染色观察发现24 h时细胞中线粒体膜电位发生变化,而且具有时间依赖性;western blot检测显示,cleaved caspase-3蛋白表达量与BAI作用时间和BAI浓度呈正相关。4.Western blot检测p-AMPK蛋白发现细胞在发生自噬的同时p-AMPK蛋白含量也增加;加入compound C后细胞生长受到抑制,不仅p-AMPK蛋白表达水平下降,LC3和cleaved caspase-3蛋白水平也呈下降趋势;另外DAPI和JC-1染色显示凋亡情况也得到了缓解。5.CCK-8结果显示BAI和TMZ单独用药U251细胞随着药物浓度和作用时间的增加细胞活力下降;TMZ和BAI联合用药后则随着TMZ浓度的增加和作用时间的延长,细胞活力出现明显的下降。结论:1.BAI可诱导胶质瘤细胞U251细胞发生自噬和凋亡。2.BAI通过激活AMPK参与BAI诱发胶质瘤的自噬和死亡。3.BAI促进TMZ的抗胶质细胞瘤作用。