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前言在现代社会不育症已成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大疾病,生殖健康逐渐引起人们的普遍重视。目前,全球大约有15%的夫妇受到不育症的困扰,导致男性不育最主要的原因是由精子生成障碍引起的。为了从根本上实现对男性不育的诊疗,需要对精子的发生过程和机制有更深入的研究。精子发生是一个非常复杂的生理过程,并且在这个过程中存在许多睾丸特异性的基因表达,由此产生一些酶类和蛋白质来调节精子的发生。许多睾丸特异性基因具有发育阶段特异性和组织细胞特异性等表达特征,这些特异性基因参与精子发生过程中特异的细胞活动,如减数分裂、遗传物质重组和染色质的浓缩以及发育后期的变态过程。当睾丸特异基因出现异常会导致少精、弱精或精子畸形等现象发生。Fankl基因是我们实验室最新筛查到的一个睾丸特异表达基因,该基因位于7号染色体,是由FnⅢ结构域和5个锚定蛋白组成的,编码一种核蛋白,该蛋白是一种睾丸组织特异转录因子。并且Fankl基因在11种脊椎动物中高度保守,其中小鼠和人的Fankl基因同源性高达85%,说明该基因在精子发生过程中具有重要的生理作用。Fankl基因在精子发生过程的减数分裂到单倍体阶段广泛表达,研究其特性和功能对揭示精子发生的内在机理、防治由精子发生异常引起的男性不育及开发避孕药物等方面有重要意义。因此通过RNA干扰的方法建立Fankl基因敲减转基因小鼠不育模型,并对基因敲减小鼠模型进行传代功能分析和表型分析,来进一步研究Fankl基因在精子发生过程中的功能及其在男性不育中的作用及意义。材料与方法一、实验材料1、人胚肾细胞系293T2、SPF级C57BL／6小鼠、B6D2F1小鼠和ICR小鼠3、细胞培养及细胞转染相关试剂4、分子克隆及PCR实验相关试剂5、RT-PCR、Real-time PCR和microRNA提取等相关试剂6、Southern blot、Western blot等相关试剂二、实验方法1、Fankl干扰载体的构建及在细胞水平的鉴定(1)pSUPER-shFankl重组质粒的构建和]pDsRed-Fankl融合表达构件的制备根据Fankl基因cDNA序列,应用http://www.dharmacon.com/在线设计软件设计2条干扰序列,分别克隆至带有H1启动子的质粒载体pSUPER-neo-GFP中，同时从成年C57BL／6小鼠睾丸组织扩增Fankl基因全序列,构建Fank1基因与红色荧光蛋白重组表达质粒pDsRed-Fank1。(2)将上述两个质粒共转染293T细胞,分别应用荧光检测、RT-PCR和Western blot等方法检测Fankl干扰载体干扰效率。2、Fankl基因敲减小鼠模型的建立(1)选取干扰效率高的siRNA表达质粒,经单酶切后,采用凝胶纯化试剂盒纯化,通过显微注射的方法注射到BDF1小鼠受精卵中,将注射基因的受精卵移植到假孕母鼠输卵管内,利用PCR和Southern blot方法对仔鼠进行检测。(2) Fankl基因敲减转基因小鼠繁育。3、Fankl基因敲减转基因小鼠表型分析(1)提取Fankl基因敲减转基因小鼠睾丸组织microRNA,应用RT-PCR技术检测Fankl siRNA在基因敲减转基因小鼠睾丸组织的表达情况。(2)通过RT-PCR、Real-time PCR和Western blot方法检测Fankl基因在基因敲减小鼠体内的表达情况。(3)对Fankl基因敲减转基因小鼠和野生型小鼠的睾丸重量、精子的数量进行比较和统计学分析；(4) Fankl基因敲减转基因小鼠与野生型小鼠交配,比较产仔数量及产仔周期并进行t检验统计学分析。结果1、经PCR检测鉴定含干扰序列的重组质粒pSUPER-shFankl 631#, pUPER-shFankl 247#及pDsRed-Fankl表达质粒构建成功,测序结果完全正确。2、转染293T细胞36h后,荧光显微镜检查发现shFank1631#、247#均能明显抑制红色荧光蛋白表达,抑制效率分别为95%和90%,RT-PCR和’Western blot结果表明Fankl基因在转录和翻译水平都受到显著抑制(p<0.05)。3、利用显微注射法将pSUPER-shFank1 631#注入BDF1小鼠受精卵原核中,共注射285枚胚胎,存活203枚,将注射后存活的受精卵分别移植到8只ICR假孕雌鼠输卵管内,共产仔53只,经PCR及Southern blot检测后共14只阳性小鼠,阳性率为26.4%。4、Fankl siRNA在基因敲减小鼠睾丸组织中均特异表达。采用半定量RT-PCR检测基因敲减小鼠睾丸组织Fankl mRNA表达与正常小鼠相比明显降低。在RT-PCR的基础上,又采用Real Time-PCR和Western blot的方法检测Fankl基因在基因敲减小鼠的表达。结果显示基因敲减小鼠的Fankl基因表达量与野生型小鼠比较都有不同程度的降低,其中F01、F02、Fo11、F045 Founder转基因小鼠Fankl基因表达明显下调。5、成年Fankl基因敲减雄性小鼠睾丸组织重量和野生型雄性小鼠睾丸组织重量进行比较,无显著性差异(p>0.05)。6、经统计学分析,Fankl基因敲减小鼠精子数量、产仔周期和产仔数量与野生型比较均有显著性差异,p<0.05。结论1、成功构建小鼠睾丸特异基因Fankl干扰载体和pDsRed-Fank1融合表达载体。经体外细胞水平实验,验证Fankl干扰载体能产生干扰效应。2、成功建立Fankl基因敲减转基因小鼠模型。3、Fankl是精子发生过程中重要的转录调控因子,转基因小鼠Fankl基因表达抑制,可导致精子生成障碍。