【摘 要】
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目的:构建一种含内部核糖体进入位点( IRES)序列的腺相关病毒表达载体,用于简便、快速地了解睫状神经营养因子(CNTF)基因在转染细胞中的表达,为进一步探讨CNTF对大鼠视网膜及
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目的:构建一种含内部核糖体进入位点( IRES)序列的腺相关病毒表达载体,用于简便、快速地了解睫状神经营养因子(CNTF)基因在转染细胞中的表达,为进一步探讨CNTF对大鼠视网膜及视神经的影响奠定基础。方法: 1.采用PCR技术,在质粒pIRES中扩增IRES序列,利用基因重组技术将IRES序列构建到腺相关病毒载体pAAV-CNTF-EGFP中。2.重组质粒pAAV-CNTF-IRES-EGFP和两种辅助质粒pHelper、pAAV-RC通过脂质体共转染AAV-293细胞,用荧光倒置显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。3.采用RT-PCR方法检测CNTF基因的表达。结果:1.重组的pAAV-CNTF-IRES-EGFP质粒经PCR筛选、酶切及测序鉴定证实构建成功。2.在荧光倒置显微镜下观察到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。3.采用RT-PCR方法在转染的AAV-293细胞中观察到CNTF cDNA的特异条带。结论: IRES序列调控CNTF与EGFP两种基因在AAV-293细胞中同时独立表达,为进一步研究用CNTF基因转染的方法来促进视神经损伤修复奠定了基础。
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