光电化学传感器检测核苷酸甲基化及其应用的研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:initial1985
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DNA甲基化和RNA甲基化是表观遗传学中非常重要的一部分,DNA甲基化与转录、基因组印记和细胞分化等生命过程密切相关,DNA甲基化的缺失与各种疾病的产生有一定的关系。虽然各种方法已经被应用到DNA甲基转移酶的检测中,但大多数方法都是操作繁琐且昂贵的。在多种RNA甲基化的修饰中,N6-甲基腺嘌呤(m6A)被认为是在所有高真核生物和病毒中最常见的一种mRNA的修饰。据近期报道,m6A的修饰与mRNA的剪接、输出、稳定性和免疫耐受有关。到目前为止,有一些m6A的检测方法已经被报道过,主要包括薄层色谱法、气相色谱法、柱液相色谱法、液相色谱法、质谱法、毛细管电泳法。虽然上述方法对m6A的检测有很大的效果,但仍存在一些不足之处。因此,有必要开发灵敏、简单、经济的m6A检测方法。除此之外,植物小RNA3’末端的2’-O-甲基基团也是RNA甲基化的一种,这种甲基化是由HEN1 RNA甲基转移酶(HENMT1)催化而成,该甲基化对核糖体的生物合成和其功能起着至关重要的作用。HENMT1可以催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基到双链RNA 3’端基的2’-O-的甲基化,该甲基化可以保护小RNA不被降解并且甲基化的3’可以防止聚尿嘧化。因此,HENMT1与小RNA的代谢密切相关,而小RNA在植物发育过程中起着基础性作用。因此,HENMT1的检测显得尤为重要。在本文中,依据不同光电材料能级之间的匹配原则,通过异质结、量子点掺杂以及离子置换,结合HRP和辣根过氧化物模拟酶PtCu NPs构建了五种不同的光电化学生物传感器实现了对m6A甲基的RNA、M.SssI甲基转移酶和HENMT1的检测。利用抗体抗原的免疫反应、生物素亲和素之间特异性反应提高了传感器的特异性和灵敏度。成功检测并比较了健康人与手术前后癌症患者、不同EMS处理的玉米幼苗叶片以及不同浓度胰岛素处理的鸡胚胎肝细胞中m6A甲基的RNA的表达量,选取了不同的农药对M.SssI甲基转移酶和HENMT1的酶抑制效果进行了探究,为m6A的调控机制的研究、动植物疾病诊断和环境激素对生物体生长调控的影响提供了新的思路,为光电化学传感器的应用开辟了新的途径。(1)基于M.SssI甲基转移酶-HpaII剪切酶体系提出了一个简单、耗费低的光电化学传感方法,实现了对DNA甲基化、DNA甲基转移酶的检测以及甲基转移酶抑制剂的筛选。以类石墨相C3N4(g-C3N4)和CdS量子点(CdS QDs)为光活性材料,当双链DNA(ds DNA)在SAM存在下被M.Sss I甲基转移酶作用后,甲基化的dsDNA不会被HpaII剪切酶剪切其端基的双巯基将会保留,然后,通过双巯基与CdS QDs的特异性结合,CdS QDs固定到甲基化DNA的端部,实现信号的扩增。当M.Sss I甲基转移酶浓度在1-80 U/mL范围内,电流的增加与M.SssI甲基转移酶的浓度成正比,检测限为0.316U/mL。除此之外,探究了莠去津和甲基吡啶磷作为抑制剂对M.SssI甲基转移酶活性的影响,该研究可为农药的致癌机制提供有用的信息,因此,光电化学(PEC)生物传感器有希望成为DNA甲基转移酶抑制剂筛选、抗癌药物研究和癌症的治疗分析的有力工具。(2)由第一部分实验可知CdS QDs可以增强g-C3N4光活性材料的光电信号,由此,在本部分中制备了g-C3N4/CdS QDs异质结。基于Cu2+对g-C3N4/CdS QDs异质结的抑制作用构建了一种新型的光电化学传感器,实现了对m6A更为灵敏的检测。实验以g-C3N4/CdS QDs异质结为光电活性材料,利用m6A抗体可以特异性识别并与m6A甲基的RNA链结合,以Phos-tag-biotin亲和素-生物素反应、磷酸基团与Phos-tag反应,实现指示剂CuO的固定,CuO经HCl处理后可释放Cu2+,释放的Cu2+置换异质结中的CdS QDs生成CuxS,生成的CuxS会阻碍光电流的产生,光电流的下降与甲基化的RNA浓度成对应关系。在最佳实验条件下,甲基化RNA在0.01-10 nM浓度范围内与光电流下降的值呈线性关系,最低检测限为3.53 pM。将研制的传感器应用到手术前后癌症患者血清中m6A甲基的RNA表达水平变化的检测,取得了很好的应用效果。。(3)由于前两部分实验所用到的CdS QDs具有毒性,因此,在本部分实验中,以Ru@Si O2增强g-C3N4的光电信号。基于羧基化的g-C3N4和亲和素修饰的Ru@Si O2(avidin-Ru@Si O2)纳米复合物构建了一种新型的、简单的和灵敏度高的光电化学传感器,实现了对m6A更高效、灵敏的检测。实验中,N6-甲基腺苷-5′-三磷酸盐(m6ATP)作为被检测的目标分子,m6A作为m6A抗体的识别位点,羧基化g-C3N4作为光活性材料和固定m6A抗体的基底,avidin-Ru@Si O2复合物作为信号放大位点提升g-C3N4的光电流,Phos-tag-biotin作为m6ATP与Ru@Si O2复合物与生物素与亲和素复合物的“桥”连接剂。在最优的实验条件下,m6A在0.01-10 nM浓度范围内与光电流呈线性相关,且最低检出限为3.23 pM,以研制的光电化学传感器评估人血清中的m6A的含量取得了良好的效果。(4)以光电活性材料Bi VO4-110-Ti O2异质结和Mo S2-AuNPs为基底材料,生物素修饰的辣根过氧化酶(HRP-Biotin)、Ag+-连接的胞嘧啶配对(C-Ag+-C)作为信号放大位点,m6A抗体为m6A的识别位点,构建了一种新型的光电化学传感器,实现了对m6A的高灵敏检测。随着m6A抗体与m6A免疫反应与发卡C-Ag+-C结构的打开,双链DNA出现,并且Ag+被释放出来。在HRP催化H2O2反应下,O2-产生,催化Ag+产生Ag沉积到AuNPs表面,作为供电子体,光电流增加。根据光电流的变化,可以成功的实现对m6A的高选择性检测,最低检出限为1.665 pM。以该PEC生物传感器检测诱变剂EMS处理的玉米幼苗叶片中的浓度、胰岛素处理鸡胚胎肝细胞中m6A的相对表达量都取得了较好的效果。(5)在前三部分对m6A的检测中,所用的光电活性材料为g-C3N4,为了增加氮化碳的比表面积,便于电子的转移,我们制备了棒状的氮化碳,实现对HEN1 RNA甲基转移酶(HENMT1)的检测。植物体内的microRNA 3’端基的2’-O-甲基是RNA甲基化的其中一种形式,该甲基化是由HENMT1催化而成,该甲基化对核糖体生物的起源和功能起着至关重要的作用。基于辣根过氧化物模拟酶PtCu纳米框架(Pt Cu NFs)催化的信号扩增实现了对HENMT1活性的检测和酶抑制剂的检测。在本工作中,Mo S2@石墨烯量子点和磷掺杂的棒状的氮化碳(MoS2@GQDs/P-RCN)异质结作为光电活性材料,GQDs的掺杂与异质结的形成使MoS2的光电活性大大增强。当3’端2 nt的粘性末端的RNA在SAM存在的情况下经HENMT1甲基后,未被甲基的双链RNA的3’端在poly(U)聚合酶的作用下会发生聚尿嘧啶反应。随后,通过杂交反应,羧基化的Poly(A)核苷酸链会被固定到电极表面,利用该链来实现PtCu@DNA的固定。在过氧化物酶模拟Pt Cu@DNA对双氧水的催化作用下,原位生成O2-电子供体,获得了较强的光电流。构建的PEC生物传感器实现了对HENMT1活性的检测,且具有较低的检测限,检测限为3.36 ng/mL。此外,抑制剂的研究表明,毒死蜱可以抑制HENMT1活性,IC50值为48.32 nM。
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