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β-香树脂醇是一种五环三萜化合物,也是其它齐墩果烷型三萜如甘草次酸、大豆皂甙等生物合成的骨架,具有抗炎、抗细菌和真菌、抗病毒及癌细胞防治功效,在降血糖、降血脂方面也具有良好效果。与很多萜类相似,β-香树脂醇在植物中的含量很低,化学合成收率不高,因而限制了其规模化生产和广泛应用。为了提高β-香树脂醇的生产能力,本文利用代谢工程和合成生物学方法在酿酒酵母中构建其合成途径,经途径和发酵过程优化,实现β-香树脂醇的高效合成。研究结果如下:首先将光果甘草β-香树脂醇合酶基因进行密码子优化并采用质粒表达,气相色谱-质谱分析证明在工程酵母SpKb中成功合成了β-香树脂醇,产量为0.75±0.06 mg/L,单位细胞产量为0.07±0.02 mg/g DCW,为进一步通过途经改造提高β-香树脂醇生产奠定了基础。基于鲨烯处于三萜和甾醇合成途径分支点的特点,以鲨烯库存量为代谢途径平衡点,设计了“推拉式”途径优化措施调控β-香树脂醇合成。首先通过异源表达白色念珠菌鲨烯单加氧酶促进鲨烯向下游2,3-氧化鲨烯的转化,然后过表达大肠杆菌IPP异构酶、酵母自身FPP合酶和鲨烯合酶增强鲨烯供应,这种“推拉式”代谢策略使β-香树脂醇产量达到36.50±1.99 mg/L,提高了49倍。依据转录因子UPC2全局调控机理,将UPC2的DNA结合位点序列(SRE序列)重构于构建途径的ADH1p、ALA1p、GPM1p、TYS1p和FBA1p启动子中,启动子强度提高了42.2%~67.5%,强化了β-香树脂醇合成途径的整体表达效率,使其产量进一步提高到48.50±2.55 mg/L,在“推拉式”途径优化基础上提高了32.9%。为了下调竞争β-香树脂醇合成的内源甾醇和乙酰辅酶A代谢分流,设计并构建了CRISPR/dCas9系统,对报告基因LacZ的转录抑制研究发现,gRNA的结构是影响CRISPR/dCas9转录抑制效果的重要因素。进而设计了一步转化、组装多个gRNA进行多基因转录下调的方法,成功将甾醇合成相关的羊毛甾醇合酶基因ERG7和乙酰辅酶A代谢相关的乙醇脱氢酶ADH1/4/5/6、柠檬酸合酶CIT2和苹果酸合酶MLS2基因的7个gRNA实现了一步组装,组装效率达40%,7个基因的转录抑制率平均达75.5%,β-香树脂醇产量比未下调内源竞争代谢的对照菌提高了42.2%,表明CRISPR/dCas9系统在酵母途径工程优化应用中的潜力。通过对工程菌发酵生产β-香树脂醇的培养条件优化,获得最优的初始pH为5.0、接种OD为0.30、初始葡萄糖浓度为35 g/L。采用乙醇补料批式发酵,使β-香树脂醇的产量提高了90.2%。通过梯度补加甲基-β-环糊精,不仅实现了β-香树脂醇向胞外的转运,而且促进了β-香树脂醇的合成,乙醇补料批式发酵方式下β-香树脂醇的产量达到156.7±8.62 mg/L,单位细胞产量达18.44±1.91 mg/g DCW,分别比初始工程菌SpKb提高了209倍和263倍。