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目的：
本研究通过分析胰腺癌细胞系中表皮生长因子受体(EGFR)、磷酸化EGFR(p-EGFR)和其下游激酶MEK1/2、ERK1/2的表达,进一步阐述胰腺癌细胞解离的分子机制。
方法：
本研究采用2种仓鼠胰腺癌细胞系——高侵袭潜能的PC-1.0和低侵袭潜能的PC-1细胞;也采用2种人胰腺癌细胞系——高侵袭潜能的AsPC-1和低侵袭潜能的Capan-2细胞。上述细胞系均以RPMI-1640培养液(Gibco-BRL,Grand Island,NY)培养,并加10％胎牛血清(Bioserum,Victoria,Australia)、100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素,于37℃含5％CO2的孵箱内培养。本研究采用兔多克隆抗体作用于人EGFR,p-MEK1/2,p-ERK1/2的氨基酸序列(Santa CruzBiotechnology,Santa Cruz,CA)、以及山羊多克隆抗体作用于人p-EGFR的氨基酸序列(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA),也利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)和若丹明标记的荧光第二抗体(Santa CruzBiotechnology)。将上述4种细胞系种植在室玻片上,并培养36h。为了评价这些胰腺癌细胞中EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2表达的变化,加入PC-1.0细胞的培养液(含解离因子DF,DF-CM)和AG1478——特异性EGFR抑制剂(Calbiochem,Darmstadt,Germany)。在活化实验中,将PC-1和Capan-2细胞加入到含有40％DF-CM的培养液中培养36h。抑制实验中,在PC-1.0和AsPC-1细胞培养液中加入10μM AG1478。另外,PC-1和Capan-2细胞经DF-CM培养36h后再继续用10μMAG1478培养36h。培养后,在室温下以0.5％多聚甲醛固定10min,再以10％山羊血清阻滞30min,之后加多克隆抗EGFR、抗P-EGFR、抗p-MEK1/2和抗p-ERK1/2抗体(1:200,以含1％小牛白蛋白的PBS液稀释),在4℃下培养过夜。最后,在室温下加若丹明(EGFR抗体为一抗)和FITC(p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2为一抗)标记的二抗培养2h。固定后,利用同聚焦激光显微镜(FV500-Ⅸ,Olympus,Japan)获取免疫荧光染色图像。对照组载玻片制备如下:①切片不用一抗处理;②用正常兔或山羊血清和非特异兔或山羊IgG来替代抗EGFR、抗p-EGFR、抗p-MEK1/2或抗p-ERK1/2抗体。利用Fluoview500(version3.3,Olympus,Japan)软件测量6个不同图像中EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2表达的平均FI值,并将6个FI值作为最终F1分析值。
实验结果
用DF处理PC-1和Capan-2细胞后,明显诱导了EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达,致使其集聚生长模式解离。相比之下,AG1478处理后,明显地诱导通常单个生长的PC-1.0和Aspc-1聚集,且抑制了其EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。
结论：
1、用DF处理PC-1和Capan-2细胞后,明显诱导了EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和P-ERK1/2的表达,致使其集聚生长模式解离。
2、AG1478处理后,明显地诱导通常单个生长的PC-1.0和Aspc-1聚集,且抑制了其EGFR、p-EGFR、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达。
这些观察表明,活化EGFR通过激活MEK/ERK信号通路而与胰腺癌细胞的解离具有密切的关系。