小鼠MPO基因的克隆、表达定位及其功能的初步研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jwk000
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髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)是一种血红素辅基蛋白酶,属于血红素过氧化物酶超家族成员之一,存在于多种细胞中,其主要功能是产生活性氧(ROS),参与多种疾病的发生和发展过程。MPO在调节血管张力、血管生成、蛋白酶活性、基因表达、翻译后蛋白质修饰、信号转导、神经递质调节以及先天性和适应性免疫调节方面发挥着重要作用。本实验以小鼠为研究对象,通过RT-PCR技术克隆小鼠MPO基因并对序列进行分析;利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)和免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)检测小鼠MPO基因及蛋白在不同组织中的表达规律和差异性;以小鼠神经元细胞(NSC-34)细胞为研究对象,通过转染si RNA和p EGFP-C1-MPO真核表达载体,运用q RT-PCR、Western blot和细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IFC)技术检测相关基因及蛋白的表达情况,对MPO基因功能进行验证。取得如下结果:1.成功克隆到小鼠MPO基因2171 bp的CDS区序列,并对其进行序列分析,结果表明小鼠MPO基因编码的蛋白属亲水性蛋白,有4个糖基化位点和52个磷酸化位点,无跨膜结构区。2.MPO在小鼠各组织中均有表达,其中在脾脏中表达最丰富,其次为心脏,肾脏中表达量显著低于其它组织(P<0.05)。3.NSC-34细胞中MPO和NADPH主要表达定位于细胞胞浆中,n NOS和i NOS在细胞核与胞浆中均有表达。4.NSC-34细胞中敲低/过表达MPO后导致细胞内n NOS、i NOS和NADPH的表达量上调/下调。总之,本研究成功克隆了小鼠MPO基因CDS区序列,进行生物信息学分析,为研究MPO的理化特性及有关信号传导机制提供理论依据;通过si RNA-MPO及MPO真核表达载体转染NSC-34细胞,探究细胞内相关基因蛋白的表达变化,为研究MPO在疾病监测和治疗中的生物学作用及其水平升高与炎症和氧化应激之间的联系奠定基础。
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